Techniques de génotypage

Annexe 1 : Techniques de génotypage

Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour différencier les génotypes du VHB, le choix de la technique dépendant de l’objectif des études menées.

1 - Séquençage et analyse phylogénétique :

Actuellement, le séquençage du génome entier du VHB et l’analyse phylogénétique constituent la méthode de référence pour le génotypage des souches de VHB.

En effet, le séquençage est devenu facilement réalisable grâce au développement de la technique de Sanger.

Principe de la technique de Sanger

Dans un premier temps, il est nécessaire d’amplifier l’ADN cible par PCR, puis de le dénaturer afin d’obtenir un ADN simple brin. A l’aide d’une amorce  spécifique et complémentaire du brin étudié (sens ou antisens), une ADN polymérase effectue alors la synthèse de l’ADN complémentaire à partir de cette amorce.

De l’extrémité 5’ vers l’extrémité 3’, cette enzyme ajoute les désoxyribonucléotides-triphosphates (dNTP) complémentaires et de manière aléatoire et inconstante des didéoxyribonucléotides triphosphates (ddNTP), par exemple un ddGTP sera parfois ajouté à la place d’un dGTP.

La réaction se faisant dans un seul tube, les ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP et ddTTP) sont marqués à l’aide de fluorophores différents pour chaque ddNTP (fluorophores « quatre couleurs »). Lorsqu’un ddNTP est incorporé à la place d’un dNTP, l’ADN polymérase ne peut plus continuer sa polymérisation. La réaction d’extension s’arrête (en effet, le didéoxynucléotide ne possède pas de groupe 3’- hydroxyle indispensable à la réaction de polymérisation de l’enzyme). Statistiquement, au cours de la réaction, pour chaque « base » de l’ADN cible, au moins une fois, un ddNTP complémentaire sera incorporé à la place d’un dNTP. Par conséquent, à la fin de la réaction, nous obtiendrons des fragments de taille différente. L’analyse de la réaction est ensuite effectuée.

Différentes méthodes d’analyse sont possibles. Aujourd’hui, l’électrophorèse capillaire réalisée sur un automate de séquençage est la méthode de choix. Lors de la migration, chaque fragment (contenant un ddNTP marqué par un fluorophore) sera excité par un laser et le signal obtenu analysé par un logiciel spécifique. L’analyse informatique des signaux permet d’obtenir la séquence étudiée.

D’autres développements de la méthode de Sanger sont néanmoins en cours et notamment la miniaturisation de la technique. A titre d’exemple, récemment des auteurs ont réussi à séquencer 600 pb en 6,5 minutes.

Séquençage et VHB

Le séquençage génomique entier reste la méthode de référence, Toutefois, la comparaison des séquences obtenues sur le génome entier et dans la région du gène S a montré que les séquences dans la région S permettaient également d’identifier précisément les génotypes de A à H. Une région intéressante pour le génotypage est la région du gène P chevauchant le gène S, dont l’amplification puis le séquençage permet l’identification du génotype dans le cadre de lecture du gène S et la détection simultanée des mutations de résistance au traitement dans le cadre de lecture du gène P.

Il faut cependant se montrer prudent dans le choix de la région analysée, les résultats du génotypage variant selon les gènes séquencés : Norder et al ont montré que les arbres phylogénétiques obtenus à partir des séquences des différents gènes de plusieurs souches de VHB diffèrent considérablement. Si la région S est la plus fiable pour le génotypage, elle ne permet cependant pas de détecter les éventuelles recombinaisons entre les souches de VHB.

Les résultats de séquençage sont comparés par rapport à un arbre phylogénétique fait de 27 différentes séquences nucléotidiques pré S/S (définissant différents génotypes et sous génotypes) enregistrées dans la GenBank.

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