Methodes

Méthodes

QUESTIONS et REPONSES

Question 1 : Indiquez, pour chaque méthode, le procédé correspondant :

Question 1 :

Question 2 : A propos des techniques d'immunologie :

a. Les anticorps monoclonaux reconnaissent plusieurs épitopes.

b. Les anticorps secondaires sont obtenus en injectant des anticorps d'une espèce donnée chez un animal d'une autre espèce.

c. La méthode ELISA révèle un signal d'intensité proportionnelle à la quantité d'antigènes présents dans l'échantillon.

d. La co-immunoprécipitation ne renseigne que sur la nature des partenaires protéiques directes de la protéine étudiée.

e. En immunohistochimie, les antigènes intracellulaires nécessitent de perméabiliser les cellules au préalable.

Question 2 : BCE

a. FAUX, justement non, les anticorps monoclonaux sont plus spécifiques que les polyclonaux et reconnaissent un seul épitope à chaque fois

b. VRAI

c. VRAI

d. FAUX, la co-immunoprécipitation renseigne sur les partenaires protéiques d'une protéine intérêt DIRECT et INDIRECT grâce à l'utilisation simultanée de différents types de marquage

e. VRAI !! À l'aide de détergents, on perméabilise les cellules pour abolir leur membrane cytoplasmique afin de permettre l'accès de l'anticorps à l'intérieur de la cellule. Ces dernières sont alors fixées, mortes.

Question 3 : Concernant les méthodes de séparation des constituants de la cellule :

a. Lors de la centrifugation différentielle classique, les microsomes sont sédimentés en utilisant une vitesse plus faible que celle utilisée pour sédimenter les ribosomes.

b. La centrifugation isopycnique permet de séparer des molécules en fonction de leur densité.

c. La chromatographie d'exclusion-diffusion sépare les molécules en fonction de leur taille.

d. Des molécules chargées négativement seront retenues sur une résine échangeuse de cation.

e. En absence de SDS et de ßmercaptoéthanol, une électrophorèse sur gel de polyacrylamide sépare les protéines uniquement en fonction de leur masse moléculaire.

Question 3 : ABC

a. VRAI, les microsomes (petites vésicules issues de la fragmentation du RE et de l'appareil de Golgi) sont sédimentés à vitesse élevée tandis que les ribosomes, plus petits, sont sédimentés à vitesse très élevée (plus élevée que celle des microsomes) longue durée.

b. VRAI, grâce à ce gradient de densité qui se forme au cours de la centrifugation et dont la valeur maximale excède la densité maximale des constituants du mélange.

c. VRAI, les grosses molécules seront éluées avant les petites molécules qui diffusent à l'intérieur des billes et empruntent ainsi un chemin plus sinueux. On parle également de chromatographie par filtration sur gel.

d. FAUX, des molécules chargées négativement sont des anions et seront, par conséquent, retenues sur une résine échangeuse d'anions.

e. FAUX, le SDS (détergent anionique) dénature les protéines et les couvre des charges négatives (toutes ont la même charge) de sorte que le seul critère de séparation lors de la migration électrophorétique est la masse moléculaire. En absence de SDS, la séparation des protéines se fera en fonction de leur charge de leur taille et de leur forme. Le βmercaptoéthanol est un agent réducteur des ponts disulfures.

Question 4 : Parmi les techniques suivantes, choisissez celle(s) qui utilise(nt) nécessairement un ou plusieurs anticorps :

a. La chromatographie d'affinité.

b. L'immunoprécipitation.

c. Le pulse chase.

d. L'ELISA en sandwich.

e. Le Western blot.

Question 4 : BDE

a. FAUX, la chromatographie d'affinité n'utilise pas nécessairement d'anticorps. L'interaction antigène-anticorps peut effectivement constituer la base de l'affinité mais d'autres interactions sont envisageables: ligand-récepteur, enzyme-substrat, polyT-polyA, etc.

b. VRAI, le préfixe "immuno" indique l'utilisation d'anticorps. dans l'immunoprécipitation, l'anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt est couplé à des billes de haut poids moléculaire qui seront faciles à sédimenter par centrifugation à basse vitesse.

c. FAUX, le pulse chase nécessite un court marquage métabolique des cellules à l'aide d'un élément marqué par un isotope radioactif.

d. VRAI, un anticorps immobilisé sur un support, un deuxième reconnaissant l'antigène capturé par le premier anticorps et un troisième (couplé à un système détectable) reconnaissant le deuxième anticorps.

e. VRAI, après séparation des protéines par SDS-PAGE, celles-ci sont transférées sur une membrane qui est incubée en présence d'anticorps dirigés contre la protéine d'intérêt. La révélation fait généralement appel à un anticorps secondaire couplé à un système détectable.

Question 5 : Au sujet de la microscopie :

a. La limite de résolution est la distance minimale séparant deux objets en-dessous de laquelle il est impossible de distinguer ces deux objets.

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