Protocole d’ensemencement des thymocytes

APO – TP 2 : Protocole d’ensemencement des thymocytes

Concentration de la suspension initiale de 5 ml de cellules = 60x10x1000x20 = 1,2*(10^7) cellules/mL

Protocole de mise en culture des thymocytes :

- Faire des allers-retours à la pipette afin de s’assurer que la suspension mère de cellules soit bien homogénéisée.

- Prélever à l’aide une micropipette, 3mL de suspension mère de thymocytes (de concentration égale à 1,2.10^7 cellules/mL) et les mettre dans un tube de 50mL.

- Ajouter dans ce même tube à l’aide d’une pipette, 9mL de milieu de culture RPMI complémenté par 10% de sérum de veau fœtal ainsi que par des antibiotiques et antimycotiques (milieu déjà prêt sous hotte) afin d’obtenir 12mL d’une suspension dont la concentration est égale à 3.10^6 cellules/mL.

- Faire des allers-retours à la pipette afin d’homogénéiser la suspension.

- Prélever à l’aide d’une micropipette, 2mL de la suspension fille (dont la concentration est égale à 3.10^6 cellules/mL) et les mettre dans un puit de plaque de culture « 6 puits ». Répéter cette opération pour chacun des 6 puits de la plaque de culture.

- Dans les 4 puits situés à droite de la plaque de culture (voir schéma ci-dessous), prélever à l’aide d’une micropipette, 2 µL de D1 (dont la concentration mère « stock » est égale à 10^-3M) afin d’obtenir une concentration finale de D1 égale à 10^-6.

- Dans le puit situé en haut, à droite de la plaque de culture (voir schéma ci-dessous), prélever à l’aide d’une micropipette, 2 µL de D2 (dont la concentration mère « stock » est égale à 20 mM) afin d’obtenir une concentration finale de D2 égale à 20 µM.

- Dans le puit situé en bas, à droite de la plaque de culture (voir schéma ci-dessous), prélever à l’aide d’une micropipette, 20 µL de D3 (dont la concentration mère « stock » est égale à 5 mM) afin d’obtenir une concentration finale de D3 égale à 50 µM.

(On n’ajoute rien dans les deux puits situés à gauche de la plaque de culture qui serviront de témoins et donc permettront un contrôle des activités des différentes drogues).

[pic 1]

- Incuber la plaque de culture dans une étuve à CO2 durant la nuit.

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