Tp rein

LAURY Emmanuel                        TP Rein

YNGVELL Madeleine

Groupe 52

Objectif du TP : 

À partir de trois échantillons d’urine A, G et E de patients adultes nous voulons déterminer lesquels sont sains ou malades, et déterminer leur pathologie (diabète, insuffisance rénale…). Pour cela, la protéinurie sera mesurée pour chacun des trois patients afin de détecter qualitativement et quantitativement la présence de protéines dans les urines, indicateur d’une pathologie rénale. Ensuite la créatininurie sera mesurée. La créatinine est un excellent marqueur de la fonction rénale. Enfin le taux de glucose dans l’urine sera mesuré, la présence de glucose dans l’urine étant un indicateur du diabète. Les mesures de la créatininurie, de la protéinurie et de la glycosurie seront réalisées par spectrophotométrie (méthode colorimétrique). Nous calculerons les ratios P/C (protéinurie/créatininurie) et A/C  (albuminurie/créatininurie). Ils serviront à détecter l’insuffisance rénale chronique (IRC), et le stade associé (micro ou macroalbuminurie...).

Protocoles : principes des dosages

∙Mesure de la protéinurie via la méthode « BioRad Assay » :

Cette méthode permet de déterminer la concentration en protéines solubilisées dans les échantillons. L’interaction entre le réactif et les protéines provoque un changement de couleur des tubes dont l’intensité est proportionnelle à la concentration en protéines (mesure de la DO à 595 nm au spectrophotomètre). La concentration en protéines dans les échantillons est déterminée à l’aide d’une gamme standard, où la DO est mesurée pour une gamme de dilutions de BSA (sérum albumine bovine) de concentrations connues. Nous utiliserons lors de nos expériences le « protein assay dye reagent concentrate » comme réactif (contient colorant, acide phosphorique et méthanol). Nous avons choisi de diluer les urines des 3 échantillons d’un facteur 10.

Protocole : 

1. Préparer 5 dilutions d’une protéine standard (utiliser le BSA avec une concentration initiale de 160 µg/mL). Nous avons choisi comme facteur de dilution ½. De plus, la courbe mesurée est linéaire pour l’albumine de 10 à 80 µg/mL
2. Pipeter 700 µL d’eau dans les tubes secs et propres
3. Ajouter 100 µL de chaque solution standard ou échantillon (urine), puis vortexer
4. Ajouter 200 µL de « dye reagent concentrate » (réactif) dans chaque tube, vortexer à nouveau
5. Incuber à température ambiante pour au moins cinq minutes.
6. Mesurer l’absorbance à 595 nm, après avoir réalisé le « blanc »

Le blanc est constitué de 700+100 µL d’eau + 200 µL de réactif.

∙ Mesure de la créatininurie via la méthode « Créatinine Jaffe » :

Le standard utilisé ici est la créatinine à 20mg/L = 177µmol/L. L’absorbance est mesurée à une valeur de λ=500 nm. On utilisera ici un point standard à la place d’une courbe standard. Nous diluons les urines des 3 échantillons d’un facteur 20.

Protocole : Nous utilisons ici la procédure « à deux réactifs ».

1. Mélanger 300 µL de réactif R1  (acide picrique à 8,73mmol/L) avec 300 µL de réactif R2 (composé d’hydroxyde de sodium à 312,5 mmol/L et de diodium de phosphate à 12,5 mmol/L) et attendre 25 secondes
2. Ajouter 60 µL du standard ou échantillon (urine), mélanger
3. Mesurer l’absorbance (A1) après l’addition du standard ou de l’échantillon
4. 3 minutes après avoir mesuré A1, remesurer l’absorbance pour chaque condition (A2). Ne pas oublier de faire le blanc : 300 µL de R1 + 300 µL de R2+60 µL d’eau

∙ Mesure de la glycosurie dans l’urine via la méthode « Glucose GODFS » :

         Il s’agit ici d’un test enzymatique photométrique « GOD-PAP ». Le principe de cette expérience est de mesurer le taux glucose après oxydation enzymatique par la glucose oxydase. L’indicateur colorimétrique est la quinone iminine. La composition du réactif est la suivante : tampon phosphate, phénol, 4 aminoantipyrine, GOD et POD. Le standard utilisé ici est à une concentration de 1 g/L (=5,55 mmol/L). Ce test est développé pour la détermination des concentrations du glucose dans un domaine de mesure compris entre 0,01 et 4,0 g/L (=0,06-22,2 mmol/L). Nous diluons les urines des 3 échantillons d’un facteur 10.

Protocole :

1. Prélever 1000 µL de réactif dans un ependorf pour chacune des conditions
2. Ajouter 10 µL d’eau distillée pour le blanc, ou 10 µL de standard ou d’échantillon (urine)
3. Mélanger, incuber 20 minutes entre 20-25 °C ou 10 minutes à 37°C

Résultats :

BioRad Assay :

Calculs de dilution du BSA : Facteur de dilution ½ , concentration initiale C°=160µg/mL

[pic 1][pic 2][pic 3][pic 4]

C°=160 µg/mL                C1= 80 µg/mL                        C2= 40 µg/mL                C3=20 µg/mL        

                        50 µL de standard BSA        25 µL du BSA                12,5 µL du BSA

                        + 50 µL d’eau                         + 75 µL d’eau                +87,5 µL d’eau [pic 5]

C4=10 µg/mL

6,25 µL du BSA + 93,75 µL d’eau

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