TP acides nucléiques

Compte rendu TP n°1 acides nucléiques

Université de Toulon

Outils Moléculaires

CH III méthode d’analyse des biomolécules

Semestre 3

14/11/2019

1. Introduction

L’acide désoxyribonucléique (ADN) est une molécule présente dans les noyaux eucaryotes, les cellules procaryotes, les mitochondries et les chloroplastes ; constituant le support de l’information génétique héréditaire. Il est composé d’une double chaîne de nucléotides de forme hélicoïdales, les quatre nucléotides sous unité de l’ADN contiennent les bases azotées adénine (A), guanine (G), cytosine (C) et thymine (T). Les bases sont assemblées selon une complémentarité exclusive : A s’apparie uniquement avec T, et C s’apparie uniquement avec G. Dans de nombreux domaines, il est nécessaire de connaitre la qualité et la quantité d’ADN présents dans des tissus biologiques afin de pouvoir exploiter celui-ci dans les applications visant son étude.

Il faut donc se demander comment faire pour mesurer la quantité d’ADN contenu dans de la matière organique et quelle est la meilleure méthode pour le faire.

Pour se faire, nous allons donc doser les acides nucléiques et définir quelle serait la technique la plus efficace pour ce dosage. Pour répondre à l’objectif, seront utilisé comme techniques la gravimétrie qui est l’analyse précise de la précipitation de composés chimiques (elle est réalisée en trois étapes), la spectrophotométrie qui est une méthode d’analyse permettant de déterminer l’absorbance d’une substance chimique c’est-à-dire sa capacité à absorber la lumière et la colorimétrie qui est une technique de dosage indirecte s’appuyant sur la loi de Beer Lambert. Ces trois méthodes permettront de déterminer la quantité d’ADN contenue dans notre échantillon de matière organique.

1. Matériel et Méthode

Afin de doser l’ADN dans un testicule d’agneau, trois expériences ont été réalisées : une colorimétrie, une spectrophotométrie à UV et une gravimétrie. Pour cela trois échantillons contenant différentes concentrations de produits biologiques contenant de l’ADN seront préparés. Pour commencer, une solution contenant : le tissu biologique, de la glace et une solution de TRIS-HCl,  a été mixée puis séparé en 2 solutions filles (une par binôme). Du filtrat sera prélevé et conservé dans un tube à hémolyse, P1. L’échantillon P1 contient donc 268mg/mL de produit biologique. Il fut ensuite ajouté du SDS à 1 % dans le volume V’1 restant avec agitation puis un mélange déprotéinisant avec de nouveau agitation jusqu’à obtention d’un « lait blanc ». Le mélange a été mis dans des tubes à centrifuger (5000 tours/min). Des tubes à centrifuger ne fut gardé que la phase aqueuse, dont une partie sera prélevée et mise de côté dans un tube à hémolyse, P2. De cette phase aqueuse sera prélevé 10mL auquel sera ajouté 1 volume d’éthanol pour extraire les fibres d’ADN. Ces premières fibres d’ADN seront mises dans un tube à hémolyse (P3). L’opération sera répétée une deuxième fois et ces dernières fibres seront mises à sécher pour en mesurer le poids.

Pendant la gravimétrie, les fibres prélevées en dernier lieu et mises sur un papier filtre à sécher seront mesurées. Pour la spectrophotométrie à UV, pour ne doser que l’ADN des gouttes de NaOH seront ajoutées aux solutions en plus du NaCl pour la dilution.

Deux valeurs d’absorbance seront choisies pour mesurer dans un premier temps l’absorbances des acides nucléiques puis celle des protéines pour vérifier s’il en reste. Pour finir,  lors de la colorimétrie ont été préparé une gamme étalon et 2 essais pour P1, P2 et P3 avec des volumes différents de TCA à 5 % et un volume égal de diphénylamine dans chaque tubes et incubés au bain-marie bouillant pendant 10 minutes, 10 minutes dans la glace puis rééquilibrage à température ambiante. L’absorbance sera alors mesurée.

Voir annexe 1 pour la partie matériel

1. Résultats et discussion

1. Dosage des acides nucléiques par gravimétrique

Lors de cette expérience, les molécules d’ADN séchées sur un papier filtre seront pesées pour en connaître leur poids.

Le papier filtre sur lequel a été déposé l’ADN pesait 0,255 et le tout 0,272g.

Donc 0,272-0,255=0,017g.

La masse de l’ADN sec sur le papier filtre est donc de 0,017g (m1).

En remontant jusqu’au V’1, le taux d’ADN contenu dans 20g de tissu biologique a été déterminé : 20g de tissu biologique contiennent 0,055g d’ADN.

Calcul de la masse d’ADN pour 1g de tissu biologique :

0,055/20=2,75.10⁻³ g.

Donc m₂=2,75.10⁻³g.

Calcul de la masse d’ADN pour 100g de tissu biologique :

(0,055*100)/20=2,75.10⁻¹g.

Donc m₃=2,75.10⁻¹g.

En calculant le taux d’ADN contenu dans différentes concentration de tissu biologique, nous nous rendons compte que pour 1g ce taux est très faible. En effet lors de notre expérience, 1g de tissu biologique ne contenait que 2,75.10⁻¹g d’ADN.

Grâce au calcul de la masse, la quantité d’ADN contenue dans les 20g de tissu biologique a pu être déterminé.

1. Dosage par colorimétrie

Afin de déterminer la quantité d’ADN contenue dans les échantillons P1, p2 et P3, une courbe à partir de la gamme étalon de l’absorbance lue à 600nm de l’ADN standard a été tracée et l’équation de la droite a été déterminée.

[pic 1]

Absorbance= 0,8505 x quantité d’ADN + 0,0184

Deux essais ont été effectués pour chaque échantillon :

Différence entre les absorbance des essais pour P1 : 0,170-0,106 = 0,064

Différence entre les absorbances des essais pour P2 : 0,702 – 0,384 =0,318

Différence entre les absorbances des essais pour  P3 :  0,386 – 0,352 =0,034

L’écart entre les essais étant inférieur à 0,5, le calcul de la moyenne des absorbance des échantillons pour chaque essai peut donc être réalisé :

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