Séquençage selon la méthode de Sanger

Séquençage de Sanger

Une des premières méthodes de séquençage, et sûrement la plus connue encore aujourd’hui a été la technique mise au point par Frederick Sanger un biochimiste ayant reçu le prix Nobel pour cette avancée scientifique.

Dans les années 70, deux méthodes ont vu le jour, celle de Maxam et Gilbert, deux américains ainsi que celle de Sanger. Cette dernière sera préférée et connaîtra de nombreuses évolutions lui permettant d’être encore très utilisée de nos jours, bien que leur principes soient les mêmes.

Tout d’abord le séquençage d’ADN est une technique qui permet de connaître sa séquence exacte. C’est utilisé en cancérologie, pour étudier le polymorphisme des gènes, test de paternité, police scientifique (reconnaissance d’individus..)

Avant de pouvoir réaliser cette étape il faut au préalable sélectionner les cellules dont on veut connaître l’information génétique, il peut s’agir de cellules sanguines, ou alors des cellules d’organismes fossilisées par exemples...Ensuite il faut extraire l’ADN de ces cellules et le purifier puis le couper par des enzymes de restriction et l’amplifier par clonage dans un vecteur d’expression pour obtenir un grand nombre de fragments de taille moyenne.

La première étape du séquençage est l’amorçage :

les brins d’ADN sont dénaturés par la chaleur et une amorce est ajoutée à la solution, souvent de 18 nucléotides, et qui fonctionne dans le sens montant, c’est à dire ciblant un seul brin des fragments d’ADN double brin de départ. L’amorce n’est pas marquée, elle est le négatif au début des brins qui vont être séquencés et servent de point de départ à cette réaction.

Vient ensuite la polymérisation : dans 4 tubes différents des préparations sont préparées avec dans chacun, les simples brins d’ADN couplés aux amorces, une ADN polymérase, des dNTP ainsi que un ddNTP radio-marqués par tube (ddATP...). La polymérase associe les dNTP libres radiomarqués aux nucléotides complémentaires présents dans la séquence du fragment d’ADN.  C’est la phase de SBS « sequencing by synthesis ».

La polymérisation s’arrête lorsque la polymérase ajoute un ddNTP au brin néo-synthétisé.Ces molécules bloquent la polymérisation de l’ADN car aucunes liaisons avec un potentiel nucléotide suivant n’est possible. La liaison entre 2 dNTP s’effectue au niveau du groupement OH du dNTP, absent des ddNTP et le premier phosphate du suivant.

Sur ce principe la polymérisation s’arrête à chaque position de nucléotide dans le brin.

La proportion de ddNTP sur les dNTP est généralement de 1 %.

Le résultats sont analysés grâce au marquage radioactif des ddNTP détecté par autoradiographie.

Après l’étape de polymérisation dans 4 tubes différents ,les brins d’ADN sont dénaturés ( on sépare du brin matrice et du brin néo synthétisé) et on récupère seulement ces derniers. une électrophorèse est réalisée sur un gel très résolutif avec 4 pistes. Les molécules sont séparées par taille avec pour chaque bande le dernier nucléotide de la séquence marqué révélé par auto radioagraphie. Avec les 4 pistes on reconstitue la séquence nucléotide par nucléotide.

Cette étape est très longue, plusieurs heures car un gel fait quelques centimètres de longueur et permet d’identifier quelques centaines de bases, la résolution devant être grande.

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