Séquençage illumina devidal roul

TP1

Utiliser les banques de données

Se repérer dans une séquence

 Prise en main d’un logiciel d’édition de plasmides (ApE)

Contexte : Dans le but de rendre des bactéries fluorescentes, on cherche un promoteur avec une forte activité constitutive afin de réaliser une fusion transcriptionnelle sur plasmide avec un gène codant une protéine capable de fluorescer. On s’intéresse aux promoteurs des gènes codant les protéines ribosomales, lesquelles sont largement produites étant donné leur rôle prépondérant dans la cellule.

Objectifs : Récupérer des informations sur des gènes d’intérêt dans des banques de données (séquences et environnement génétique/ signaux d’expression) et construire la séquence théorique d’un vecteur correspondant à la fusion transcriptionnelle entre le promoteur choisi et le gène de la gfp porté par le plasmide.

Pour cela nous allons visiter 2 banques de données, l’une présentant l’organisation génétique de Salmonella et l’autre répertoriant tous les sites de démarrage de la transcription détectés. Pour la construction de la séquence théorique du vecteur d’intérêt, nous utiliserons le logiciel d’édition de plasmide Ape.

Aller à l’adresse suivante pour télécharger le logiciel Ape

https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/

Préambule                                        

Afin de sélectionner un promoteur conduisant l’expression d’une protéine ribosomale, nous allons d’abord repérer les gènes rps (ribosomal protein small subunit) et rpl (ribosomal protein large subunit) codant les protéines ribosomales.

Visitons le site KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)

https://www.genome.jp/kegg/

Code organism: sey pour Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344

A- Repérer et sélectionner la séquence promotrice d’intérêt                                        

Nous allons nous intéresser au gène rplK (rpl pour ribosomal protein large subunit). Nous allons repérer son site de démarrage de la transcription pour en déduire la région promotrice en amont. Celle-ci sera clonée dans le plasmide pUA66 afin de diriger l’expression du gène gfp.

Les sites de démarrage de la transcription des gènes de Salmonella sont répertoriés à l’adresse suivante. L’organisme de référence est l’espèce S. enterica serovar Typhimurium SL1344.

Dans la case blanche centrale, au-dessous des coordonnées du génome, remplacer le contenu de la case par le nom du gène.

1- Donner le locus tag du gène rplK chez S. enterica serovar Typhimurium SL1344.

2- Le gène est-il codé par le brin sens ou anti-sens du génome de Salmonella ?

3- Repérez-vous un site de démarrage de la transcription en amont de rplK et quelle organisation génétique anticipez-vous ?

4- Donner la nature du nucléotide et la coordonnée correspondant au site de démarrage de la transcription (+1).

5- Quelles sont les coordonnées du gène rplK ?

6- Quelle est donc la longueur de la région 5’-UTR ?

7- Créer un fichier Ape dans lequel vous mettrez la séquence incluant le site de démarrage de la transcription (+1) de rplK et les 150 nucléotides en amont.

Pour sélectionner cette séquence zoomer suffisamment sur la partie séquence de sorte à afficher celle-ci à l’écran en bornant en 3’ avec le +1. Puis, utiliser « reference sequence » et « save track data ». Dans le fichier Ape s’assurer d’avoir le nucléotide correspondant au +1 comme dernier nucléotide côté 3’ et éliminer les nucléotides surnuméraires du côté 5’ pour avoir au total 150 nucléotides. Sauvez le fichier sous le nom PrplK.

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