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Groupe principe transgenèse

Arthur Truffet

Aurore Debuire

Juliette Pougault

Benoit Pamponneau

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Definition

On définit la transgénèse par l'insertion de matériel génétique exogène, dit transgène, dans un organisme pour modifier son génome.

L'insertion doit être permanente et transmissible à la descendance. De plus le phénotype associé au transgène doit s'exprimer dans l'organisme receveur.

But

Cette technique qui a permis l’étude approfondie du génome est encore utilisée notamment pour conférer une ou des caractéristiques spécifiques à un organisme receveur.

On dissocie transgénèse aléatoire et ciblée:

La transgénèse aléatoire (à l'inverse de la ciblée) ne permet ni de contrôler la zone génétique d'insertion ni le nombre de transgènes insérés.  

Transgenèse aléatoire

Les premières expériences de transgénèse aléatoire eurent lieu en 1980, sur le modèle murin, grâce à la technique de micro injection.

        Principe

1. Intégration de l'ADNc dans un vecteur 

La première étape est d’identifier et de sélectionner le transgène d’intérêt. Pour pouvoir intégrer notre gène d'intérêt dans un génome, il est nécessaire d'utiliser un vecteur qui intègrera notre séquence dans celles de l'organisme receveur. (1er schéma) Pour cette technique le plasmide est le vecteur le plus adapté car nous utilisons de l’ADNc

Un plasmide est composé d'une origine de réplication, d'un gène de résistance à un antibiotique, de sites de restrictions, un terminateur et un promoteur.

Le transgène et le plasmide sont incubés en présence d'enzymes de restriction afin de permettre l'insertion du transgène dans le vecteur. Il y a ensuite légation avec la T4-DNA ligase.

Quand le vecteur intègre le transgène on parle de vecteur recombinant.

Ce vecteur recombinant est alors inséré dans des bactéries afin de l'amplifier. Les bactéries sont sélectionnées par l'antibiotique dont le transgène possède un gène de résistance puis mis en culture

De cette façon, on prépare une grande quantité de vecteur avant de les transfecter dans les cellules hôtes par micro-injection. 2ème schéma

c) Micro-injection

        L'injection a lieu dans l'un des deux noyaux fournis par les cellules sexuelles mâle et femelle, juste avant qu'ils ne fusionnent. L'embryon est ensuite transplanté dans l'oviducte ou l'utérus d'une souris pseudo-gestante (femelle qui a été accouplée avec un mâle vasectomisé, cette femelle est alors mise dans un état hormonal permettant l'implantation et le développement des embryons).

De cette façon, 10 à 30% de la descendance intégrera le gène étranger au sein du génome de leur gamète.

d) Intégration du vecteur

L’intégration du vecteur se fait par la jonction d'extrémités non-homologues C’est un mécanisme de l'ADN qui permet de réparer des cassures double brin. Il est non conservatif, c'est-à-dire  qu'il ne restaure pas la séquence initiale de l'ADN; mais seulement la continuité de l'ADN endommagé. Cela entraîne donc un changement de l'information génétique.

        Les protéines Ku 70/80 sont les premières molécules qui interviennent en interagissant avec les deux extrémités d'ADN résultant de la cassure. Elles vont ensuite recruter la DNA PK ADN dépendant qui va maintenir les extrémités coupées à proximité tout en recrutant Artemis. Cette dernière va couper les extrémités afin de permettre à la ligase IV d'agir en liant les nouvelles extrémités entre elles.

        Ainsi, le plasmide recombinant portant le gène d'intérêt  va profiter de la réparation pour s'intégrer dans le génome au niveau des cassures double brins endogènes.

Le plus souvent, le vecteur va s'intégrer  dans des zones d'euchromatine car plus accessible.

e) Sélection

La dernière étape de la transgenèse est de vérifier si le gène d'intérêt a bien intégré le génome.

        On connaît la séquence du gène d'intérêt donc on peut réaliser une biopsie (par exemple au niveau de l'oreille) sur la descendance pour en extraire l'ADNg. On va ensuite réaliser une PCR pour amplifier la séquence d'intérêt et la détecter ensuite à l'aide d'oligo dT complémentaire du transgène.

        Pour aller plus loin

La nature du promoteur va déterminer le niveau d'expression du transgène.

• un promoteur dit « fort »  permettra une forte transcription du transgène
• un promoteur dit « faible » sera utilisé si l'on souhaite que notre transgène ait une expression moindre.
•  De même si l'on veut exprimer le transgène dans un tissus spécifique on utilisera un transgène s'exprimant uniquement dans le tissus d’intérêt on parle de promoteur tissus-sélectif ou tissus-spécifique.
• promoteur ubiquitaire sera capable d'induire la transcription du transgène dans tous les tissus de l'organisme.

        Enfin, l'utilisation d'un promoteur inductible est également possible ; celui-ci ne sera actif qu'à l'ajout d'un élément exogène spécifique. Par exemple, un promoteur n'étant sensible qu'à l'éthanol, ne s'activera et induira la transcription seulement en présence d’éthanol.

        Il est aussi possible de réaliser un séquençage du génome afin de savoir où s'est intégrée la séquence.

        Une RT-PCR est également envisageable dans le cas où l'ARNm serait codant, afin de visualiser la transcription du transgène.

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