Protocole Extration d'ADN

Objectifs : 

Découvrir les différentes étapes et techniques primordiales pour une extraction d’ADN à partir de cellules buccales (salive). Se familiariser avec les contrôles qualités.

Matériel et équipements nécessaires :

• Tube Falcon
• Tubes Eppendorf
• Pipettes + cônes
• Centrifugeuse
• Vortex
• Microdroplet
• Varioscan

Réactifs :

• 5 mL de PBS (liquide physiologique)
• Tampon de lyse
• ARNse
• Solution de la précipitation des protéines
• Isopropanol
• Ethanol
• Tampon de re-suspension

Mode opératoire :

• Récolte d’échantillon

• Récupérer l’ADN (ici, dans les cellules de la cavité buccale (salive)).

• Mettre 5mL de PBS pour aider à obtenir une bonne quantité de salive
• Cracher dans le tube Falcon
• Prélever 1,5 mL dans un tube d’Eppendorf
• Mettre l’échantillon à la centrifugeuse pendant 2 minutes à 10.000 g (vitesse maximale).
• Récupérer le culot, en retournant rapidement le tube pour enlever le surnageant
• Rajouter 1,5 mL de salive dans le tube d’Eppendorf
• Remettez l’échantillon à la centrifugeuse dans les mêmes conditions précédentes
• Répéter l’opération une troisième fois

Cette étape permet d’isoler dans un premier temps l’ADN des éventuels microbiotes, déchets alimentaires que l’on peut retrouver dans la cavité buccale.

• Lyse des cellules

• Destruction des cellules pour que l’ADN « sort » du noyau.

• Ajouter 600 µL de tampon de lyse au culot (lyse dite « chimique »)
• A l’aide de la pipette réaliser des mouvements aller/retour jusqu’à disparition du culot jusqu’à sentir une viscosité (lyse dite « mécanique »).

• Isolation de l’ADN

• On veut obtenir que l’ADN génomique

• Ajout de 3 µL d’ARNse (va permettre de dégrader l’ARN dans l’échantillon)
• Mettre l’échantillon pendant 37°C pendant 10 minutes (à température ambiante de l’enzyme)
• Sortir l’échantillon et le laisser à température ambiante de la salle pendant 5 minutes

• Précipitation des protéines

• Permet d’éliminer les agglomérats

• Ajouter 200 µL de la solution de la précipitation des protéines (pH acide)
• Passer au vortex, pour homogénéiser l’échantillon
• Laisser dans la glace 5 minutes
• On va éliminer les déchets encore présents avec la protéine en passant à la centrifugation pendant 4 minutes à vitesse maximale.
• En parallèle, on prépare 600 µL de propanolol dans un tube d’Eppendorf
• On ajoute le surnageant dans ce nouveau tube d’Eppendorf

Visuellement, on peut observer en agitant un peu le tube l’ADN en forme de « méduse », l’ADN est condensé sur lui-même.  

• On met à la centrifugeuse pendant 1 minute à vitesse maximale

Visuellement, on observe une petite tâche blanche qui correspond à l’ADN

• Ajouter 600 µL EtOH 7% (pour nettoyer le culot : enlever le sel …)
• Passer à la centrifugeuse pendant 1 minute à vitesse maximale
• Jeter par renversement le surnageant
• A l’aide d’un papier absorbant sécher le tube au maximum
• Ajouter entre 20 à 100 µL de tampon (dépend de la taille du culot obtenue) pour remettre en suspension

• Dosage des protéines

• Utilisation d’un Varioscan

• Régler l’appareil à une absorption de 260 nm (absorption des cycles aromatiques : correspondant aux acides nucléiques)
• Ajouter 2µL du témoin (tampon)
• Ajouter 2µL de l’échantillon contenant l’ADN
• Lire l’échantillon (l’unité : mg/mL)

On veut 500 ng/mL de solution d’ADN, réaliser un calcul pour obtenir la quantité que l’on veut en complétant avec du tampon de re-solubilisation.

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