Outils et bases moléculaires - préparation des acides nucléiques

1) La structure des acides nucléiques

Ils sont composés d’une base et d’un sucre (soit un ribose pour l’ARN ou un desoxyribose pour l’ADN). Les bases sont cycliques : les purines (guanine et adénine) et les pyrimidines (cytosine, uracile et thymine)

Les sucres sont hydrophiliques, contrairement aux bases.

Sucre + base = nucléosides. Ex : l’uridine

Sucre + base + phosphate = nucléotide  (Le phosphate se met en 5’ sur le sucre) Ex : le dAMP

Polymérisation par condensation

Tout les acides nucléiques sont synthétisé de la même façon : on rajoute une base sous forme triphosphate. Réaction catalysée par des enzymes de types polymérases.

Structure d’un polynucléotide

En 5’ on a un phosphate, en 3’ un OH. La synthèse et la lecture d’un acide nucléique se fait de 5’ -> 3’

Appariement entre bases complémentaires

Une Thymine avec une Adénine par 2 liaisons H (ADN) ou A-U (ARN). Cytosine avec Guanine par 2 liaisons H (ADN et ARN)

Dans l’ADN on a 2 brins antiparallèles.

Modèle de la double hélice d’ADN

Les bases sont dans le petit sillon. Et dans le grand sillon, on trouve le squelette sucre-P. On a 10 bases par tour d’hélices (34 A°)

L’ARN

Le sucre est un désoxyribose, qui est plus hydrophile car il a un OH. C’est pourquoi l’ARN fait très rarement des doubles hélices.

Bases : A,G,C,U

L’ARN est généralement une molécule linéaire et a tendance à se replier sur lui même. On aura alors différentes structure : en épingles à cheveux ou en boucles.

Ex ARN ribosomique : on a une seule molécule. Le repliement est automatique avec les bases qui s’apparient entre elles.

Points clés :

• les acides nucléiques forment des polymères commencant par un phosphate en 5’ et finissant par un OH en 3’
• Appariement entre les bases (A/T, A/U C/G)
• Les séquences des deux brins sont complémentaires et d’orientation antiparallèles.

2) purification de l’acide nucléique

Les acides nucléiques sont séparés des autres molécules présentes dans les cellules en utilisant leur spécificité physico-chimique :

Grande taille, PM élevé

Forte charge négative (Phosphate)

Hydrophilique ou hydrophobique selon le pH et la concentration.

2 étapes principales :

• lyse pour libérer et solubiliser les acides nucléiques : La méthode de lyse doit être adaptée à l’échantillon de façon à faciliter la purification et à préserver l’intégrité des acides nucléiques.
• Élimination chimique ou enzymatique des contaminants (protéines, polymère de sucres, autres acides nucléiques, inhibiteurs, etc.)

Préparation de l’ADN génomique

• Broyage, avec azote liquide qui fragilise les structure, puis ajout d’un détergent qui va casser les cellules et disperser les bicouches lipidiques, inactiver la plupart des protéines et commencer à enlever les protéines associé à l’ADN (les histones)
• On obtient alors une solution très visqueuse = l’Adn : très long filaments s’opposant aux écoulement hydrodynamique
• Déprotéinasation de la solution = extraction avec des solvants organiques (mélange phénol/chloroforme) => protéine dénaturées -> précipité à l’interface phénol-eau. L’ADN en solution dans la phase aqueuse.
• Précipitation de l’ADN par addition de sel et d’éthanol ou d’isopropanol. L’ADN est collecté puis centrifugué. Ensuite, dissous dans tampon ou eau.

Pour éliminer les ARNs -> traitement par ARNase.

Préparation de plasmide

Exemple : lyse alcaline de bactéries

• centrifuger les bactéries (E .Coli)
• éliminer le surnageant
• Resuspendre les bactéries dans 250 micro litre d’une solution de 0,2M NaOH, 1% SDS
• Neutraliser avec 250 microlitre d’une solution d’acétate de sodium à 3M pH 5,2
• Centrifuger pour éliminer les débris cellulaires.

Le surnageant contient le plasmide qui est purifié par précipitation.

Extraction par les solvants organiques :

On rajoute du mélange phénol/chloroforme qui ne se mélange pas avec l’eau. Ensuite on passe au vortex pour faire une émulsion, puis on sépare les 2 phases par centrif. Et on récupère deux phase : la phase phénolique est en bas, la phase aqueuse et au dessus. Et entre les deux, l’interphase : c’est ou se trouve toutes les protéines. Ensuite récupération de la phase aqueuse contenant les acides nucléiques.

L’ADN est dans la phase aqueuse si le pH > 7,5

L’ARN est dans la phase aqueuse si le pH < 5

Exemple de protocole pour analyser les organismes non cultivables

• ajouter solution d’extraction (0,3% SDS)
• extraction au phénol/chloroforme
• Précipitation des acides nucléiques avec 2 volumes d’éthanol
• Analyse des acides nucléiques (PCR, SB, NB)

Purification sur colonne échangeuse d’anions

• liaison ionique grâce aux fortes charges négatives de l’ADN
• élution avec un sel (NaCL, KCl)

Purification sur colonne de silice

• déstabilisation des liaisons hydrogènes en présence d’agent chaotropique (guanidium, perchlorate de lithium, urée…) qui permet une liaison ionique ou hydropobe sur la matrice de silice.

• ajour d’un agent chaotropique à l’ADN
• fixation de l’ADN sur la résine de silice
• lavage avec une solution d’alcool
• élution avec de l’eau ou 10 mM tris pH 8

Purification par ultracentrifugations

On utilise un gradient de densité continu en chlorure de césium. Utilise de grande quantité de bromure d’éthidium (agent intercalant potentiellement mutagène)

Comparaison des méthodes de purifications

Précipitation : + rapide, rendement élevé, adaptable sur une grande plage de condition 20ng/ml – 10mg/ml)

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