Matériels et méthodes

              MATERIELS ET          METHODES[pic 1]

  I- Matériels : 

1. Produits et Solutions utilisés :

On utilise :

Pour l’extraction et la purification de l’ADN :

• xylène.

• Ethanol absolue.

Pour la digestion à la protéinase k :

    Tampon de lyse:

-Tris HCL 1M pH:8   ,

-EDTA 0.2 M,

      -Nacl   5M ,

      -SDS    10%  ,

      -Eau distillée .                          

Pour purification  de l’ ADN:

• Phénol chloroforme,

• Acétate d’ammonium,

• Isopropanol,

Pour PCR :

     -Buffer ,

     -dNTP,

     -Mgcl2,

     -Primers ,

     -Taq polymérase,

     -Eau ,

      -Echantillon d’ADN à amplifier,

Pour révélation par éléctrophrèse :

        Sur gel de polyachrilamide :

    -l’acrylamide 6 %,

    -l’argent AgNO3 ,

    -la soude : Na2CO3,

    -Urée,  

    -formaldéhyde ,

    -APS,

    -TEMED(C6H16N6) ,

    -acide  acétique,

    -eau distillé,

  sur gel d’agarose :

    -poudre  d’agarose ,

    - tampon TAE ,

2- Appareils, Outils et Verrerie utilisés :

    Les principaux équipement du laboratoire de biologie moléculaire.

⇨Un thermocycleur,  

⇨ Systèmes d'électrophorèse,

⇨Une hotte de PCR,      

⇨Une centrifugeuse réfrigérée,

⇨Une centrifugeuse pour tube eppendorf,

⇨ Deux fours à hybridation,

⇨ Un PSM(post sécurité micro biologique II)pour l'extraction d'ADN,

⇨Système de prise de vue,

⇨Un système de purification d'eau (distillateur),

⇨Appareil pour photo gel lié a un système informatique ,

⇨Bloteur ,

⇨Pompe ,

⇨Deux  hôtes chimiques ,

 ⇨Tubes à essai stériles,

⇨Portoir des tubes à essai,

⇨Autoclave,

⇨Plaque pour peser,

⇨Sacs de plastique stériles ,

 ⇨Couteau stérile,

 ⇨Pinces,

⇨Ciseau,

⇨Broyeur,

 ⇨Etuve à température réglable,

 ⇨Pipettes stériles de 2 et 5 mL,

⇨Pipettes Pasteur stériles,

 ⇨Microscope photonique,

 ⇨Marqueurs.

3- Matériels biologiques :

Tissus frais ou paraffiné issu de l’institut national d’hygiène à rabat .

 II- Méthodes

    La démarche suivi est une extraction et purification du matériel génétique ,puis une amplification génique et enfin une révélation par technique d’électrophorèse.

1. Extraction et purification de l’ADN :

1. Principe :

        Utilisation de la solubilité différentielle des molécules (acides nucléiques / contaminant ) entre deux phases non miscibles .

2-2 But :

         Utilisées pour élimination les impuretés de l’ADN (des substances indésirables) comme des protéines ou du bromure d’éthidium ; elle  constitue une étape clé de toutes les études de génétique moléculaire .selon le matériel de départ ,cellules ou organes ,la première étape qui a pour effet de casser les membranes cellulaire sera utilisé par homogénéisation en présence de détergents (SDS) ou par broyage dans un mortier rempli d’azote liquide .la purification repose ensuite sur l’élimination enzymatique des protéines cellulaires par action dans un premier temps ,de la protéinase K puis extraction au phénol chloroforme (les acides nucléiques ne sont pas solubles dans le phénol et sont  retrouvés dans la phase aqueuse ).la purification doit se faire en présence d’EDTA (éthylène diamine tétra-acétique ),inhibiteur des nucléases cellulaires .après extraction ,l’ADN est précipité à l’aide de l’éthanol froid ou d’isopropanol en présence de  sels .

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