L'objectif Du TP Est D'étudier L'influence De La Concentration De Substrat

Compte rendu: Étude cinétique et détermination du pH optimum de la phosphatase alcaline.

I. But:

L'objectif du TP est d'étudier l'influence de la concentration de substrat et du pH sur la vitesse de la réaction d'hydrolyse.

Réaction catalysée par la phosphatase alcaline:

Dans cette réaction, la para-nitrophenyl phosphate (pNPP) est un substrat qui est catalysée par une enzyme, la phosphatase alcaline. Deux produits se forment le para-nitrophénol (pNP) et l'hydrogénophosphate.

L'étude du pH, permet de déterminer l'activité maximale d'une enzyme. C'est le pH optimum. À ce pH, l'enzyme possède une conformation bien déterminée qui va lui conférer son activité maximale.

II. Principe:

1. Étude de l'influence de la concentration de pNPP.

On varie six fois la concentration de pNPP pour déterminer son influance sur la réaction.

a) Gamme étalon de para-Nitrophenol.

La réalisation d'une gamme d'étalonnage est indispensablecar elle permet de déterminer une absorbance à une longueur d'onde de 410nm, pour six tubes donnés (G1-G6) transférer dans une cuve de spectrophotomètre de 10dm. À l'aide de l'absorbance on peut calculer la concentration en pNP dans chaque tubes. Il faut donc préparer six tubes contenant de 0 à 0,05mM de pNP, en présence de Tampon Tris-HCL 0,1 M pH 8,3, de ZnCl2 (sert de cofacteur) et de l'eau. Pour la réalisation de la game d'étalonnage et du dosage, le volume final de liquide dans chaque tube doit être identique.

b) Mesure de la vitesse de réaction en fonction de la concentration de pNPP

On va réaliser une réaction enzymatique qui libère du pNP, qui peut être observée par l'apparition de la coloration jaune. On prépare six solutions de substarts de concentrations différentes, 2,5mM; 1mM; 0,5mM; 0,25mM; 0,167mM et 0,125mM. Puis on prépare sept milieux réactionnels en présence de Tampon Tris-HCL, de ZnCl2, de l'eau distillée et de du pNPP. Ensuite on doit incuber le mileu réactionnel et la solution de phosphatase alcaline qui sert à réaliser les cinétiques. On réalise une mesure toutes les 10secondes pendant 3minutes pour déterminer la concentration du produit, le para-nitrophénol (pNP).

Il est nécessaire de préparer un huitième tube, qui sert de témoins. Pour déterminer l'action de l'enzyme sur la réaction.

2.Détermination du pH optimum.

On va préparer 4 milieux réactionnels comme précédement de pH différents. Puis 4 cinétiques qu'on mesure toutes les 10 secondes pendant 3 minutes pour déterminer l'activité maximale de l'enzyme et le pH optimal

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