L'adn Complémentaire

Test 2-3 : l’ADNc chez les eucaryotes (source = Monsieur Dudley)

Le clonage de l’ADN est la production d’un grand nombre de molécules identiques, pour analyser la structure et la fonction d’un gène. Une collection de séquences d’ADN s’appelle une banque et on peut avoir des banques d’ADN complémentaires quand le matériel du départ est l’ARNm ou des banques d’ADN génomique quand on commence avec l’ADN qui est présent dans le noyau.

Au cours de la procédure de purification (= isolement) des ARN cytoplasmiques de cellules eucaryotes, on vérifie la qualité de la préparation sur un gel d’agarose comportant du formaldéhyde pour dénaturer les structures secondaires de l’ARN. Les bandes principales sont celles des oligo dt et la queue de polyA . Les ARNm eucaryotes ont une taille moyenne de 9 à 16 kpb.

Il est impossible de cloner l’ARNm, il faut transformer les ARNm en ADN en utilisant une enzyme d’origine virale, la transcriptase réverse . Cette enzyme est une ADN polymérase qui peut utiliser comme matrice soit de l’ARN, soit de l’ADN mais, en commun avec toutes les polymérases, il faut une amorce pour commencer la synthèse, qui se déroule de 5’P et 3’OH en complémentarité . L’amorce que l’on utilise est un ARNm. Avant la synthèse du deuxième brin il faut éliminer l’ARNm. Cela peut se faire soit avec une enzyme : l’ADN polymérase, soit avec la soude à 0,1M. Sur la molécule d’ADNc simple brin, il y a la formation spontanée d’une « épingle à cheveu » qui va servir d’amorce pour la synthèse du deuxième brin. Pour cette étape, on peut utiliser le fragment de klenow à la place de l’enzyme qui a été utilisée pour faire la copie du premier brin d’ADNc.

Avant de cloner l’ADNc, il faut éliminer l’« épingle à cheveu » en utilisant la nucléase S1 qui est spécifique pour l’ADN simple brin (mais aussi pour l’ARN).

Les ADNc double-brin qui sont produits sont à bouts francs.

Pour faciliter le clonage de ces ADNc, on va rajouter, à leurs deux extrémités, des séquences appelées en anglais des linkers (en français : lieurs ). La particularité de ces séquences est de comporter un insert par une enzyme de restriction (par exemple, EcoRI qui reconnait la séquence 5’GAATTC ET 3’CTTAAG).

Avant d’ajouter ces linkers, on va traiter les fragments à cloner par la méthylase spécifique de l’enzyme de restriction, qui va protéger les sites internes de coupure.

C’est une .............. qui assurera la synthèse des liaisons covalentes de type .............. entre les inserts et les ADNc.

L’insertion dans le vecteur peut maintenant être réalisée.

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