Hydrolyse enzygmatique

Hydrolyses enzymatiques

1. Introduction

Les aliments ingérés ne sont pas directement assimilables par l’organisme. Au cours de la digestion les aliments subissent divers actions mécaniques et chimiques. . Le but est de réduire le poids moléculaires des aliments pour les transformer en nutriments absorbables. La digestion chimique consiste en une hydrolyse sous l’action d’enzymes sécrétées par les glandes digestives. La cinétique enzymatique est régit par plusieurs facteurs comme la température et le Ph. Le système digestif a des Ph différents selon les zones (Intestin grêle, estomac). Le pancréas exocrine secrète dans le duodénum plusieurs enzymes dont la lipase pancréatique, l'α-amylase, la pepsine et la trypsine.

Le but du tp est de s’interroger sur les facteurs influençant l’hydrolyse enzymatique et sur les réactions catalysées par les enzymes étudiées.

1. Méthode

Les expériences sont réalisées dans un bain marie ou incubateur à 37/ 40°C. Ces températures correspondent aux températures corporelles. Ainsi les expériences sont effectuées dans les conditions physiologiques de température.

1. Hydrolyse enzymatique des glucides

L’objectif est de suivre au cours du temps l’hydrolyse de l’amidon et d’en déduire les produits formés.  Le ph est de 7.

• Choix de la dilution

Diluer l’α amylase est nécessaire pour obtenir une activité compatible avec l’étude de sa cinétique. Une concentration trop importante d’enzyme entraine une hydrolyse trop rapide et ne permet pas de distinguer les caractéristiques d’une réaction.

2 dilutions sont faites avec un facteur de dilution 1/5 et 1/10

Calcul des volumes à prélever :

Dilution 1/5 : 0,2 ml à prélever

Dilution 1/10 : 0,1 ml à prélever.

Après incubation à 40°C, on observe :

• Tube 1 (1ml solution de pancréatine à 1%) : jaune clair
• Tube 2 (1 ml de dilution 1/5) : marron
• Tube 3 (1 ml de dilution 1/10) : bleu intense

La dilution 1/5 est le bon intermédiaire à utiliser.

Cette étude est basée sur le test au Lugol et sur la réaction de Fehling.

Le témoin 1 est composé d’amidon et de lugol. La couleur obtenue (bleu intense) correspond au taux de polymérisation de l’amidon. Une couleur jaune clair indique une absence d’amidon. On peut en déduire l’avancement de l’hydrolyse au cours du temps.

Le témoin 2 : on effectue une réaction de Fehling sur une solution d’amidon. La couleur est bleue clair. L’amidon n’a pas de fonctions réductrices.

1. Hydrolyse enzymatique des lipides

Le principe de la méthode est d’étudier l’action de la lipase pancréatique sur la margarine en utilisant le principe de la saponification.

Une émulsion est réalisée pour faciliter l’action de la lipase pancréatique. En effet, l’émulsion des graisses augmentent la surface d’action pour les enzymes. Pour se faire, la solution margarine – agar-agar – Amidon est vortexée fortement (comparable à la désagrégation mécanique faite dans l’estomac et l’intestin grêle.)  Les gouttelettes étant instables, il est nécessaire de verser rapidement dans une boite de pétri et de laisser refroidir.  

Une solution de pancréatine est versée sur la moitié de la boite et de pétri. L’autre moitié ne contient pas de solution. On incube à 40 °C  pendant 1h.

Ensuite, une solution de sulfate de cuivre est utilisée pour réaliser une saponification à partir d’acide gras libérés par la margarine. Le savon est identifiable par sa couleur verte. Ceci indique une présence d’acide gras libre et donc d’une hydrolyse des triglycérides de la margarine. Une absence de changement de couleur témoigne d’une absence d’hydrolyse enzymatique.

1. Hydrolyse enzymatique des protéines

• Pepsine

La réaction de Biuret permet d’étudier le degré d’avancement de l’hydrolyse de l’ovalbumine. Les paramètres étudiés sont le Ph et l’état de l’enzyme.  En présence de liaisons peptidiques, la couleur est violette et en absence de liaison, la couleur est bleue. 3 témoins sont effectués pour avoir des éléments de comparaison.

Témoin 1 : L’urée n’a pas de liaison peptidique. La couleur observée est Bleue.

Témoin 2 : L’urée fusionnée a un peu un petit nombre de liaisons lipidiques. La couleur est rose/violet

Témoin 3 : L’ovalbumine est composée d’un grand nombre de liaisons peptidiques. La couleur observée est violette.

4 tubes sont effectués dont le contenu est indiqué dans l’annexe. Après une incubation de 30 min (40°C), la réaction du Biuret est réalisée.

Connaissant le nombre relatif de liaisons peptidiques de nos témoins, on peut identifier le degré d’avancement d’hydrolyse. Il sera observé grâce au changement de couleur du violet au bleu.  

• Trypsine

Le principe de la méthode est d’étudier le degré d’avancement de l’hydrolyse de l’ovalbumine en fonction du Ph.

L’opacité des tubes indique le degré d’avancement de l’hydrolyse. Une solution est translucide quand il a eu hydrolyse. Elle est opaque en absence d’hydrolyse observée.

Pour déterminer le ph basique  des solutions 2 et 3, la phénolphtaléine est utilisée. C’est un indicateur qui prend une couleur spécifique selon le ph. Connaissant les couleurs correspondantes, on obtient une solution ph 8,3 (rose clair) et une solution ph 10 (Fuchsia). Un papier ph est utilisé pour confirmer le ph.

 On utilise de l’acide borique pour obtenir un ph acide (5) et de l’eau distillée pour un ph neutre (7).

1. Résultat et discussion

1. Hydrolyse des glucides

-        Test de Lugol

Entre le tube 3 et 4 (soit 5 min), il n’y a pas de changement très visible de coloration. Le degré d’avancement de l’hydrolyse est très faible. Au bout de 3 min (tube 5), on remarque un changement de couleur franc : violet. Le taux de polymérisation est donc plus bas que celui du tube 4.  

Le tube 6 est brun orangé.  L’hydrolyse continue.

La différence de couleur entre le tubes 7,  8, 9, 10 est difficilement discernable. Donc à partir de 14min, le taux de polymérisation diminue rapidement.  

...