Extraction de l'ADN

Manipulations

Premère étape: Extraction de l'ADN

1) Rincez notre bouche pendant 30 secondes à l'aide de 10ml de solution saline et

recracher dans le verre.

2) Transférer, à l'aide d'un compte-goutte, 1000ul de salive dans un microtube de 1,5 ml.

3) Mettre dans la centrifugeuse 90 secondes.

4) Jeter le plus de surnageant possible pour qu'il reste 0,1 ml de dépôt cellulaire.

5) Remettre en suspension les cellules du microtube avec une micropipette et transférer

30ul de ce liquide dans le microtube 0,5ml, contenant 100ul de résine (chelex©).

6) Mettre le microtube dans le thermocycleur à 99°C pendant 10 minutes puis agiter

pendant 5 secondes.

7) Mettre à la centrifugeuse 90 secondes puis déposer immédiatement dans la glace.

8) Pipeter 30ul de surnageant et le mettre dans un nouveau tube pour former notre

échantillon d'ADN.

Deuxième étape: Amplificatio de l'ADN.

9) Ajouter, dans l'enceinte biologique et à l'aide d'une micropipette stérile, 22,5 ul de

solution préparée et attendre quelques minutes.

10) Prélever 2,5 ul de surnageant clair, sans toucher au culot contenant des débris et

l'ajourer au sein de la solution.

11) Ajouter 25 ul d'huile minérale et Remettre dans la glace tout de suite après.

12) Insérer les tubes à ACP dans la centrifugeuse pour quelques secondes.

13) Mettre dans le thermocycleur pour que s'effectue la dénaturation, l'hybridation et

l'élongation.

14) Remettre sur la glace.

Troisième étape: Digestion de l'ADN

15) Récupérer notre tube à ACP et prélever 10 ul de notre ADN qui se trouve sous la

couche d'huile.

16) Mettre le prélèvement dans un nouveau microtube de 0,5 ml bien identifier et avec la

mention de témoin.

17) Mettre sur la glace.

18) Prélever 1 ul de l'enzyme de restriction Haelll et l'insérer directement dans l'ADN de

notre tube à APC. Faire cette étape dans l'enceinte biologique et à l'aide d'une

micropipette à embout stérile.

19) Identifier le tube avec la lettre D (digestion) et le remettre

...