Etude de l’activité des MMPs gélatinases

TRAVAUX PRATIQUES BIOLOGIE CELLULAIRE 2020-2021 :
Compartiments de la cellule et sécrétion des protéines
Etude de l’activité des MMPs gélatinases

1. Introduction et but du TP :

La matrice extracellulaire (MEC) est un ensemble de macromolécules extracellulaires très organisé qui détermine la structure et le fonctionnement du tissus. C’est un réseau synthétisé par des fibroblastes fluide, en évolution constante car sa composition diffère en fonction des situations physiologiques, pathologiques et des différents tissus. Elle est constamment renouvelée, car elle subit un remodelage qui consiste à la synthèse et la dégradation de certains de ses constituants.

Ce phénomène peut être réalisé par les MétalloProtéases Matricielles (MMP), qui dégradent des chaînes protéiques permettant le remodelage de cette matrice. Ce sont des protéases à zinc, sécrétées localement dans le milieu extracellulaire sous l’influence de cytokines ou de facteurs de croissance.

Pendant ce TP, nous étudierons la sécrétion et l’activité des gélatinases MMP-2 et MMP-9 à travers une électrophorèse SDS-PAGE et une zymographie sur gel de gélatine suive d’une électrophorèse SDS-PAGE. Pour cela, des fibroblastes HTK cultivés dans un milieu de culture complet sont d’abord traités, ou non, pendant 24 heures avec de la cycloheximide (drogue a effet tardif) ou pendant 4 heures seulement pour la colchicine (car c’est une drogue très toxique pour les cellules).

1. Matériels et Méthodes :

Tout d’abord, nous devons étudier la sécrétion et l’activité des gélatinases MMP-2 et MMP-9. C’est pour cela que les fibroblastes HTK ont été cultivées avec 2 drogues. En effet, la cycloheximide est un antifongique qui bloque la synthèse protéique et la colchicine empêche la polymérisation d’hétérodimères d’α/β-tubuline. Pour comparer, il y aura un témoin non traité.

Pour observer l’influence de ces drogues sur les cellules, une première centrifugation du milieu conditionné (MC) a été réalisée par les fibroblastes, ce qui a permis l’élimination des débris cellulaires. Ensuite, il y a eu une lyse des cellules et une deuxième centrifugation dans le but de récupérer le contenu protéique intracellulaire et le sécrétome. Le dosage des protéines dans le lysat cellulaire a été réalisé par la méthode BCA (Bicin Choninic Acid).

Lors de ce TP, nous utilisons la technique de l’électrophorèse SDS-PAGE. Elle permet la séparation des protéines en fonction de leurs poids moléculaire uniquement. En effet, le dodécylsulfate de sodium (SDS) est un détergent qui dénature les protéines, les charge négativement et coupe les liaisons faibles. L’acrylamide permet la formation du gel.

Deux types de gel polyacrylamide SDS-PAGE ont été réalisés, un avec gélatine : le gel de concentration, et un autre sans gélatine : le gel de séparation. Grâce au gel de concentration il y aura une entrée homogène des protéines, cela nous permet d’analyser l’activité des gélatinases. Le gel de séparation a pour rôle la séparation des protéines, pour ensuite déterminer les tailles et quantités de protéines dans chaque culture cellulaire.  

On réalise une électrophorèse SDS-PAGE avec les échantillons des lysats de colchicine, de cycloheximide et un lysat témoin, déposés dans les puits selon les volumes calculés. Un tampon marqueur de poids moléculaire est également intégré. Enfin, on effectue la migration.

La zymographie permet l’observation de l’activité enzymatique, elle concerne donc uniquement le gel qui contient les MC des drogues, le MC témoin et un tampon marqueur de poids moléculaire. On l’exerce à la suite d’une électrophorèse SDS-PAGE. On plonge le gel dans 2 bains de triton à 2,5% pendant 30 minutes. Le triton est un détergent qui déplace SDS, ce qui est nécessaire pour renaturer les protéines. Le gel est ensuite incubé à 37 degrés dans un bain de tris-HCl (tampon réactif), il y aura donc une restauration de l’activité des MMPs.

Ensuite, on colore le gel a l’aide du bleu de Coomassie. C’est un réactif capable de détecter les protéines, ainsi les protéines seront colorées. Enfin, on décolore le gel, cela nous permet de voir plus facilement les bandes protéiques (bandes bleues pour le gel sans gélatine et blanches pour le gel avec gélatine).

1. Résultats zymographie et gel SDS-PAGE :

1. Dosage des protéines

Pour quantifier les protéines des échantillons, il faut faire une gamme étalon avec des concentrations connues d’une protéine, telle que l’albumine bovine (BSA). Pour cela, les valeurs de DO qui correspondent aux valeurs de la concentration de 10 µl de BSA nous ont été données. Ainsi, une courbe étalon a été tracée (voir Annexe 1). Cela nous a permis de déterminer la concentration protéique des 3 échantillons (E), car il faut déposer la même dans chaque puits du gel SDS-PAGE. (Voir les calculs dans l’annexe 1)

1. SDS-PAGE sans gélatine

Passons à l’analyse des résultats et du niveau d’expression des MMP-2 et MMP-9 sur gel, grâce aux résultats obtenus sur la migration des lysats cellulaires sur SDS-PAGE (voir Annexe 2). Sur les profils de migration l’intensité des bandes sont proportionnelles à la quantité de protéines chargées, ici elles sont toutes égales. Selon le site uniprot.org, le poids moléculaire des MMP-2 est à 73 kDa et pour les MMP-9 à 79 kDa. Sur le gel sans gélatine, le bleu de Coomassie va se fixer sur les protéines donc les bandes protéiques seront colorées en bleu. On peut constater que le profil de migration témoin est presque semblable à celui de la colchicine. De 10 kDa à 70 kDa, il y a une expression un peu plus intense chez la colchicine. Ce résultat est cohérent car la colchicine est une drogue inhibant le transport vésiculaire. Les protéines synthétisées ne seront pas sécrétées, ce qui provoque une surexpression des protéines, donc la colchicine a un effet inhibiteur total. Pour le témoin, il y a la présence de nombreuses bandes intenses, ce qui montre une synthèse de protéines importante mais aussi leurs sécrétions. Sur le profil de migration traité à la cycloheximide, on peut voir qu’il n’y a plus rien après 70 kDa. Il y a une variation du nombre de bandes et d’intensité. Cela traduit une variation de synthèse ou de sécrétion des protéines. En effet, cette drogue à un effet tardif sur les protéines, elle inhibera que partiellement la synthèse protéique. Il y aura uniquement l’inhibition de la synthèse des nouvelles protéines et il restera la synthèse des protéines ajoutées avant l’inhibiteur. En comparant les 3 migrations, on observe une bande commune aux 3 lysats cellulaires située à environ 70 kDa. On peut supposer que cette bande représente les MMPs, car la MMP-2 a un poids moléculaire de 73 kDa et MMP-9 a un poids moléculaire de 79 kDa. Nous pouvons donc en conclure que ces drogues impliquent une diminution de l’expression et de la sécrétion des protéines.

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