Détermination Du Site Actif D'un Peptide Synthétique Par HPLC

Compte Rendu du TP :

Détermination du Site Actif d’un peptide synthétique par HPLC

But.

Le but de ce TP est de préciser la localisation du site actif d’un peptide synthétique avec un glycosaminoglycane naturel : l’héparine grâce à l’HPLC : Chromatographie liquide à Haute Performance.

II. Principes.

Chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions :

Cette chromatographie est l’inverse de la chromatographie d’adsorption en phase normale, c’est à dire qu’elle va séparer les composés en fonction de leur hydrophobicité. La phase stationnaire va donc être plus hydrophobe que la phase mobile, et plus le soluté sera hydrophobe, plus il sera retenu sur la colonne. La phase stationnaire est à base de silice plus ou moins greffées de chaines alkyles. L’élution se fera par augmentation croissante du degré d’hydrophobicité de la phase mobile.

Avec cette technique, on va associer un appariement d’ion, afin de solubiliser des molécules telles que des protéines, car celles ci sont trop peux solubles dans l’eau pour faire une chromatographie échangeuse d’ions, et trop ionisées pour une chromatographie d’adsorption.

On va donc ajouter un « ion compensateur » ici l’acide Trifluoroacétique (TFA) qui est chargé négativement et est hydrophobe, ce qui va neutraliser le peptide en formant des paires d’ions, ce qui va aider à solubiliser le peptide, et réduire le caractère ionique du peptide, permettant une meilleure séparation.

α-Chymotrypsine :

C’est une enzyme protéolytique qui va couper de préférence après un acide aminé aromatique, dans la séquence peptidique étudiée, il n’y a que la phénylalanine comme acide aminé aromatique, ce qui donnera deux fragments.

Chromatographie liquide à Haute Performance :

Cette chromatographie est basée sur le principe d’une colonne contenant une matrice homogène et incompressible, d’une granulométrie comprise entre 3 et 10µm, ne laissant aucun espaces vides, de plus, le fait d’utiliser des capillaires entre l’injecteur et la colonne permet une séparation encore plus précise, puisqu’en sortie de colonne, les solutés séparés ne peuvent se re-mélanger. En contrepartie, pour maintenir un débit constant, malgré la finesse des capillaires, il faut utiliser des pompes assez puissante (d’ailleurs il y a une confusion dans la signification du P de HPLC entre Pression et Performance)

III. Conditions Opératoires de l’HPLC.

Colonne utilisée :

Phase stationnaire en Silice greffée en C8

Porosité de 300Å

Granulométrie de 7µm.

Dimension : 3cm x 2,1mm

Phase mobile :

Débit : 1mL•min-1

Composition :

Solvant A : TFA 0,1% (dans l’eau)

Solvant B : Acétonitrile 90%, TFA 0,1%

Programme de Gradient :

Conditions initiales : 95% de A et 5% de B = étape de fixation, état initial de la colonne

En 12 minutes : augmentation progressive de B jusqu’à atteindre 30% de B et 70% de A = étape de séparation

En 2 minutes : retour à l’état initial de la colonne : 95% de A et 5% de B = étape de remise en condition initiale

(Rappel : Tous les solvants et échantillons injectés en HPLC doivent au préalable être filtrés sur un filtre à 0,45µm afin d’éviter tout dégâts sur la colonne.)

Détection :

Microcellule de détection UV, réglée sur 214 nm, car à 280 nm (autre longueur d’onde possible) il n’y a que les acides aminés aromatiques qui absorbent, et dans notre peptide il n’y a qu’un seul acide aminé aromatique (la phénylalanine), donc à 214 nm, on va pouvoir tout détecter y compris, c’est pour cela qu’il faut faire attention aux « pics fantômes » en cas de présence d’impuretés.

Nature et Volume des échantillons injectées :

Dans ce TP, nous n’avons pas cherché à être quantitatif, mais qualitatif, donc nous avons injecté tout le volume de nos préparation, dans le but d’obtenir des résultats les plus qualitatifs possibles, ce qui correspond à plus ou moins 250µL pour le « blanc » de l’expérience et le peptide non digéré (=témoin), 150µL pour le peptide digéré, et 350µL pour le peptide contenant le site actif de l’enzyme.

Noms et rôles des produits utilisés lors de cette manipulation :

α-Chymotrypsine : Enzyme protéolytique qui va digérer le peptide de préférence après un résidu d’acide aminé aromatique.

DTT : Dithiothréitol, agent réducteur qui va dénaturer l’enzyme (réduction des ponts disulfures des protéines)

Tampon NaCl (0,15M et 1M) / Tris-HCl (pH 7,4) : éviter la dégradation du peptide par variation trop importante de pH et force ionique

PMSF : Fluorure de phénylméthylsulfonyle : Inhibiteur des protéases à Sérine. Il va inhiber l’α-Chymotrypsine.

Acétonitrile : Solvant polaire aprotique (contrairement à l’eau qui est protique)

IV. Résultats et interprétations.

Notre peptide a pour séquence :

Ala-Val-Glu-Leu-Arg-Ser-Pro-Gly-Ile-Ser-Arg-Phe-Arg-Arg-Lys-Ile-Ala-Lys-Arg-Ser-Ile-Lys-Thr-Leu-Glu-His-Lys-Arg-Glu-Asp-Ala-Lys-Glu

Selon le tableau des caractéristiques des acides aminés, on compte :

7 acides aminés Hydrophobes

20 acides aminés Polaires

On peut donc dire que notre peptide est plutôt polaire.

Lors du test blanc,

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