Compte rendu electrophorèse et Immunodetection

TP : ELECTROPHORESE DE PROTEINES, ELECTROTRANSFERT ET IMMUNOREVELATION

Réalisé par Antoine Bondarenko et Léa Cassulino

Encadré par Madame GERARD-BARAGGIA

Groupe C1

BUT:

 Lors du TP Lysozyme, nous avons extrait puis purifié le Lysozyme à partir d’une extraction de blanc d’oeuf par chromatographie échangeuse de cations . Nous avons récolté différentes fractions et nous avons su que la protéine a été purifiée car son enrichissement avait augmenté au cours de la purification. Ainsi, l’objectif de ce TP est de vérifier cette purification du Lysozyme. Nous avons donc tout d’abord effectué une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en milieu dénaturant que nous avons coloré avec le bleu de Coomassie brillant R250 afin de connaître la pureté et la composition des échantillons. Ensuite, afin d’identifier le Lysozyme et de déterminer sa pureté, nous avons réalisé une immunorévélation suivie d’une coloration au rouge de ponceau.

D’autre part, nous devions déterminer la structure d’une Immunoglobuline G (IgG) via une électrophorèse.

PRINCIPES:

Electrophorèse :

C’est une technique de séparation et de caractérisation des espèces. Les particules chargées électriquement sont séparées par migration différentielle sous l'effet  d'un champ électrique. Les molécules chargées positivement (les cations) vont migrer vers la cathode chargée négativement et les molécules chargées négativement (les anions) vont migrer vers l’anode chargée positivement.

Selon différents paramètres (charge, masse, forme, nature du support, conditions physico-chimiques), la vitesse de migration va être variable, ce qui permet la séparation des différentes molécules. A partir de cette technique, il existe différents types d’electrophorèses.

Pour ce TP, nous avons utilisé un gel de polyacrylamides en milieu dénaturant (mélange Acrylamide/bis Acrylamide 40%). Cette méthode repose sur la séparation des molécules en fonction de leurs poids moléculaires. On appliquera à nos échantillons différents agents dénaturants tels qu’une solution composée du SDS, Tris-HCl (tampon pour maintenir la solution tamponnée), du glycérol (permet d’augmenter la densité des échantillons afin qu’il se dépose plus facilement dans les puits), du bleu de bromophénol et ou d’une autre solution composée de β-mercaptoéthanol en plus.

Le SDS est un détergent anionique qui dénature les protéines et qui leur confère une charge négative. Ainsi, elles migreront toutes vers le pôle positif, ce qui va permettre de différencier les protéines par leur masse moléculaire. Le Bleu de bromophénol est utilisé comme marqueur coloré afin de vérifier l'évolution d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide, il est légèrement chargé négativement à un pH neutre, il migre alors dans la même direction que les protéines sur le gel.

Le β-mercaptoéthanol est un agent réducteur qui va exercer une action dénaturante sur les protéines en rompant les ponts disulfures ce qui désorganise leur structure tridimensionnelle. Les sous-unités des protéines sont donc dissociées et vont donc migrer plus rapidement. Le gel de polyacrylamide est obtenu par polymérisation d'acrylamide qui forme des chaînes et de bis-acrylamide qui reproduit les chaînes d'acrylamide. La réaction de polymérisation est initiée par la formation de radicaux libres par le persulfate d'ammonium et catalysée par le TEMED, cela va former

un maillage dans lequel plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, plus la densité des chaînes est élevée et les mailles du réseau sont serrées.

De ce fait, plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, moins les molécules volumineuses peuvent migrer et cela permettra de séparer de plus petites molécules qui migreront plus loin.

La distance de migration d’une molécule est spécifique, ce qui nous permet d’identifier sa pureté, en comparaison à des témoins de poids moléculaire connus. La révélation des bandes se fait

grâce à un colorant le bleu de Coomassie.

[pic 1]

Immuno-révélation:

Technique permettant d’identifier le lysozyme grâce à des anticorps anti-lysozyme. Ces anticorps se fixent à la lysozyme via des enzymes, les peroxydases, auxquelles ils sont reliés.

Un substrat, le 4C1N, sert ensuite de révélateur en provoquant une coloration spécifique suite à sa réaction avec la peroxydase.

Coloration au Bleu de Coomassie:

Colorant utilisé pour visualiser les protéines sur les gels d’électrophorèse après la migration. Cette molécule (Coomassie Brilliant blue G-250) interagit avec les protéines via des liaisons non-covalentes.Ce colorant possède une affinité particulière avec les protéines, ce qui lui permet de pénétrer rapidement au sein d’un gel de polyacrylamide. Il y a donc une fixation du colorant bleu sur les protéines.

 [pic 2]

Coloration au Rouge Ponceau:

Le colorant au Rouge Ponceau est utilisé pour la mise en évidence de n’importe quelle protéine. Sa structure moléculaire lui permet de se lier aux acides aminés chargés positivement, mais aussi de créer des liaisons non-covalentes avec les parties apolaires d’une protéine.

 [pic 3]

RESULTATS:

Echantillons:

Afin de procéder à la migration par électrophorèse, nous avons dû produire des échantillons des fractions F1,F2 et E1 de manière à ce que 10µL de ces échantillons contiennent 5µg de protéines. Les tubes M, IgG1 et IgG2 avaient été préalablement préparés par les encadrants.

 [pic 4]

Erreur : Pour E, ça n’est pas 0,625 mais 62,5µL.

Nous avons ici en rouge, les volumes calculés à partir des concentrations obtenues lors du TP de purification.

Pour la fraction F1, nous avions une concentration protéique de 15,3mg/mL, pour la F2, 14,35mg/mL, et pour la E1, 0,5mg/mL.

Afin de déterminer le volume à extraire des fractions nécessaire à la production des fractions, j’ai calculé de la manière suivante:

Pour l’échantillon de la fraction F1 : Nous avons déterminé la masse en µg, pour 1µL de solution de F1, de protéines. Donc, pour 1µL=15,3^-3µg=0,2µg. Afin de connaître le volume nécessaire pour arriver à 5µg pour 10µL, il suffisait ensuite de diviser 5/0,2=25µL.

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