Compte rendu de TP “Primoculture de cellules fibroblastiques d’origine ventriculaire d’huître creuse Crassostrea gigas “

Compte rendu de TP “Primoculture de cellules fibroblastiques d’origine ventriculaire d’huître creuse Crassostrea gigas “

Introduction

La primoculture est une culture cellulaire primaire utilisée pour la prolifération des cellules in vitro ou hors de leur organisme. Elle est une technique de laboratoire indispensable pour manipuler et étudier le fonctionnement ainsi que l’organisation des cellules. La culture primaire cellulaire est aujourd’hui une des méthodes les plus utilisées dans la recherche scientifique plus précisément en génétique. Cette culture primaire s’applique à plusieurs espèces animales, végétales ou marines comme les huîtres creuses.

En vue d'approfondir nos connaissances sur la primoculture, nous avons réalisé un TP sur la culture des cellules fibroblastiques d’huître creuse c.gigas. Le but de ce TP est de :

-          Réaliser une culture cellulaire à partir des ventricules cardiaques d’huître creuse

-          Donner le rôle de chaque produit utilisé dans le protocole de TP

-          Décrire les techniques d’asepsie en culture cellulaire

-          Décrire le rôle des cultures cellulaires

Mots clés :

Primoculture, aseptie, cellule fibroblastique, ventricule cardiaque, prolifération

Protocole expérimentale

Ø  Matériel utilisé

-          Matériel biologique : trois huîtres creuse

-          Broyeur ou Homogénéiseur de Dounce

-          Broyeur ou Homogénéiseur de Dounce

-          Tube à fond conique (50ml)

-          Hotte à flux laminaire

-          Trypsine-EDTA

-          Boîte de Pétri stérile

-          Liquide de Dakin

-          Boite de culture

-          Milieu de culture EMF/L15/AB

          EMF : Eau de Mer Filtrée

          L15 : Sérum de Veau Fœtal

          AB : Antibiotique

-          Centrifugeuse

-           Brosse à ongle

-          Microscope inversé

Description du protocole

Tout d’abord, les 3 huîtres sont nettoyées à l’eau par brossage et désinfectées par immersion dans l’alcool à 70% pendant quelques secondes. Les huîtres sont ensuite ouvertes par section du muscle adducteur dans des conditions stériles (asepsie). Ensuite les zones de prélèvement d'organes sont lavées à l’aide d’une solution d’eau mer filtrée EMF additionnée de Tween 20 d’une part et puis rincées avec une solution de mer filtrées seule d’autre part. Le ventricule cardiaque est ensuite prélevé (après rupture de la membrane péricardique) pour chaque huître à l’aide d’un scalpel et mise dans une boîte de petri contenant du Dakin (pour une désinfection) pendant 15 minutes.

Après rinçage des cellules ventriculaires dans le milieu EMF/L15/AB, ceux- ci sont broyés dans un homogénéiseur ou broyeur de Dounce stérilisé et contenant préalablement 12 ml de milieu EMF/L15/AB. Ensuite, pour une dissociation enzymatique et mécanique des cellules, nous avons ajouté au contenu du broyeur 1,5 ml de trypsine/EDTA.La trypsine EDTA favorise la digestion des cellules et des tissus adhérents. Cette digestion est assumée par la trypsine dilué au 1/8eme dans un milieu de culture (EM/L15/AB).

Remarquons que la dissociation enzymatique et mécanique se fait par le mouvement d’un piston dans le broyeur : trois coups de piston les trois premières minutes puis un coup par minute pendant les sept minutes suivantes.

 Après 10 min de broyage, la suspension cellulaire est transvasée dans un tube stérile à fond conique de 50 ml contenant au préalable du milieu EM/L15/AB/SVF décomplémenté. Remarquons que la solution de SVF est décomplémenté pour permettre la dénaturation des protéines (sans toutefois les détruire) contenu dans le milieu de culture mais aussi l’ajout du milieu EM/L15/AB/SVF permet d’atténuer ou de supprimer l’action de la trypsine. Les cellules ainsi dissociées sont centrifugées à 2000 tour pendant 15 min à 20°c.

Après centrifugation le culot de cellule est remis en suspension dans 5 ml de milieu EM/L15/AB/SVF décomplémenté. Ici le SVF (Sérum de veau foetal) permet aux cellules d’être maintenues dans un milieu adéquat à leur croissance et prolifération. Puis mise en culture dans deux boîtes stériles de 25cm2 dont l'une est polylysinée.

Les boîtes de culture sont incubées à 20' C, à l'obscurité.

[pic 1]

Rôle de chaque produit utilisé lors de ce protocole

v  Polylysine :  permet l’adhérence des cellules au substrat

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