Compte-rendu de TP : Etude d'un test Elisa

TP d’immunologie 1 : Test ELISA

1. Introduction

Lors de ce TP, nous avons effectué le test ELISA direct, qui est un test quantitatif. Il s’agit d’une technique immuno-enzymatique permettant de détecter la présence d’anticorps ou d’antigène immobilisé dans un puits.

La détection d’anticorps est un processus important, il sert de test de dépistage lorsque l’on est atteint d’une pathologie virale.

Nous chercherons durant ce TP à détecter dans 4 sérums de lapin, la présence ou non d’un anticorps anti-gène A dans les cellules.

1. Réalisation et résultats

1. Matériel et méthode

Lors de ce TP, nous travaillerons sur une plaque à 96 puits (8x12) à fond plat pour pouvoir regarder la coloration du milieu par spectrophotométrie.

Plan de plaque :

On annote les 4 sérums de lapin P1, P2, P3 et P4.

Schématisation de la plaque et des différentes étapes :

[pic 1]

Etape 1 : On cherche à fixer les antigènes (Ag) dans les puits. Un tampon particulier appelé solution d’immobilisation va permettre à l’Ag de venir se coller aux puits.

On laisse incuber pendant 1h30, puis on retire la solution d’immobilisation par retournement : seuls des Ag collés sur le puits resteront.

Le but est de quantifier la quantité d’Ag collés sur le puits.

Etape 2 : On veut détecter une protéine d’intérêt, donc on verse un Anticorps (Ac) dessus. L’anticorps peut se fixer partout car la membrane permet d’accrocher les protéines. On doit alors bloquer les sites spécifiques.

Pour ça, on prend du lait en poudre : sa protéine majoritaire est la caséine, qui va bloquer tous les sites spécifiques. La caséine viendra tapisser le fond du puits. Ainsi, les anticorps spécifiques en solution pourront venir se fixer.

En effet, l’Ag est fixé de façon aspécifique sur le plastique. On ne sature pas tous les sites de fixation. Pour éviter la fixation aspécifique, on ajoute donc une grosse quantité de protéine pour que la fixation soit spécifique sur les antigènes.

Note : Lors de chaque lavage, on utilise une solution de PBS/Tween. Cette solution va permettre de perméabiliser les cellules aux anticorps qui ne peuvent pas entrer dans la cellule.

Le PBS est une solution tampon phosphate salin qui contient du chlore de sodium, du phosphate disodique et du chlorure de potassium. Il sert surtout à rincer les cellules pour enlever toute trace du milieu et maintient l’homéostasie des cellules vivantes.

Quant au Tween, c’est un détergent qui va enlever tout ce qui n’est pas bien fixé sur la plaque.

Etape 3 : On va regarder une réaction colorimétrique. Au lieu de mettre un substrat qui émet de la lumière, on va mettre un substrat qui une fois dégradé colore la solution : Le tétraméthylbenzidine. On aura une coloration bleue qui va arriver dans le puits.

Le tétraméthylbenzidine est un substrat colorant qui révèle l’enzyme peroxydase ajoutée avec la solution d’anticorps.

Etape 4 : Si on attend indéfiniment, tous les puits seront de la même couleur et il sera impossible de distinguer les puits concentrés ou non en antigène.

Il est donc important d’arrêter la réaction lorsqu’il reste encore du substrat à l’aide de l’acide sulfurique afin de pouvoir observer les différences de concentration d’Ag entre les puits.

En effet, l’acide sulfurique va bloquer la réaction car celui-ci stoppe l’action de la peroxydase. Le produit formé par le TMB sous l’action de la peroxydase prendra une couleur jaune.

On passe ensuite les puits au spectrophotomètre à 450nm pour avoir une intensité de coloration.

Résultats de la spectrophotométrie à 450nm :

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