Clonage d'un fragment DBD du gène RFX3 dans un plasmide puc19

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Introduction

        Le clonage est l’une des techniques de base du génie génétique. La première étape consiste à insérer un fragment d’ADN d’intérêt dans un plasmide, un fragment d’ADN circulaire contenant, en plus de l’insert, un gène sélecteur, qui ici, sera un gène de résistance à l’ampicilline ; ainsi qu’un gène rapporteur, le gène lacZ, permettant de visualiser l’activité du gène d’intérêt. Dans notre cas, nous étudierons la région génique contenant l’exon codant un domaine de facteur de régulation de l’expression des gènes RFX3 permettant à ce facteur de se lier au promoteur des gènes cibles. Ce domaine se nomme DBD pour DNA Binding Domain :

>NM_011265.3:753-934 Mus musculus regulatory factor X, 3 (influences HLA class II expression) (Rfx3), transcript variant 1, mRNA

CTGCAATGGCTGCTGGACAATTATGAGACAGCGGAGGGAGTGAGCCTGCCGAGGAGCACGCTGTACAACCACTACCTTCGACACTGCCAGGAGCACAAGCTGGACCCGGTCAATGCCGCCTCTTTCGGAAAACTAATAAGGTCCATTTTTATGGGGCTACGAACTAGGAGATTAGGCACTAG

        Par la suite, ce plasmide, par transformation, sera intégré dans une cellule hôte : dans notre cas, nous travaillerons avec des bactéries Escherichia coli de souche DH5α. Au fur et à mesure que la bactérie se divise, si elle a intégré le gène d’intérêt, elle le transmettra à la cellule-fille, et ainsi de suite.

        Toutefois, réaliser cette méthode de clonage requiert des manipulations tierces permettant d’arriver à ce résultat. Ainsi, notre objectif sera de montrer par quels moyens nous arriverons à cloner cet exon DBD dans le plasmide bactérien afin de l’intégrer dans notre cellule hôte.

        Pour ce faire, nous avons besoin de l’élément de base, l’ADN génomique. Ainsi, en premier lieu, l’ADN génomique de souris doit être extrait. S’ensuit l’amplification de l’exon DBD par PCR à qui succèdera la double digestion du produit PCR et l’extraction sur gel de l’insert. A ce même moment, nous double digérerons notre vecteur, ici, le plasmide bactérien pUC19. Subséquemment aura lieu l’étape de ligation, importante pour lier le gène d’intérêt au vecteur. L’étape de transformation de bactéries compétentes et culture sur boîte viendront clôturer ces manipulations avec la miniculture des colonies blanches et la minipréparation d’ADN plasmidien.

Matériel et Méthodes

Bio-informatique : recherche préalable.

        Les outils de bio-informatiques vont nous permettre de retrouver, à partir de l’ADN génomique, la position des amorces, établir la carte de restriction de ce fragment et également de choisir les enzymes de restriction pour le clonage de l’exon DBD. Ces informations vont nous être nécessaires pour la suite des opérations.

        Tout d’abord nous avons eu besoin du site NCBI qui nous a permis de récupérer la séquence du gène RFX3 que l’on trouve sous la référence >NC_000085.7:c27995287-27739121 Mus musculus strain C57BL/6J chromosome 19, GRCm39.

        Par la suite nous avons voulu positionner les amorces sur le gène RFX3 : ainsi nous avons utilisé la catégorie stssearch du site EMBOSS explorer qui va nous permettre d’établir une compatibilité avec la séquence nucléotidique des amorces M3A/M3B et du gène RFX3. Cet outil va nous donner la position des amorces sur le gène, et donc indirectement, la taille du fragment à amplifier étant entouré des deux amorces : forward en position 186897 et reverse en position 187489 par rapport au gène RFX3 : cela nous donne un fragment PCR à amplifier de 592pb. Puisque les deux amorces sont spécifiques de cette région génique, nous savons que le produit PCR contiendra l’exon DBD. Voici un schéma résumé :

[pic 6]        Ensuite, nous devons retourner sur le site NCBI afin d’avoir la séquence nucléotidique du produit PCR. Pour ce faire, nous utilisons la rubrique Change region shown pour restreindre la séquence au produit PCR enfin d’avoir le produit à amplifier de 592pb. Ensuite, pour vérifier que la séquence de l’amorce reverse est bonne, nous utilisons l’outil revseq du site EMBOSS explorer qui nous permet de simplement « lire dans le sens inverse ».

        Par la suite, il nous faut positionner l’exon DBD par rapport au fragment amplifié. Pour ce faire, nous devons retourner sur le site NCBI et enregistrer la séquence ARNm (variant 1) Mus musculus regulatory factor X, 3 (influences HLA class II expression) (Rfx3), transcript variant 1, mRNA 3 de l’exon 753..934. Subséquemment, sur le même site, nous allons utiliser l’option Blast qui va nous permettre d’aligner les deux séquences : ProduitPCR (Query) et exonDBD (Subject). Nous remarquons ainsi que l’exon s’aligne avec le produit PCR de la position 199 à 380 :

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Enfin, l’outil restrict du site EMBOSS explorer va nous permettre de choisir deux enzymes qui vont couper sur le produit PCR autour de l’exon. Il a fallu s’assurer que les sites de restrictions associés à ses enzymes soient bien présents sur le pUC19 et sur le produit PCR (entre 144 et 489) ; et bien sûr s’assurer que les enzymes de restrictions soient compatibles grâce à thermofisher. Ainsi, nous avons sélectionné selectionné EcoRI (position 166) et Sal I (position 399).

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Amplification d’un fragment du gène RFX3 par PCR 

        Désormais, nous souhaitons obtenir « n exemplaires » de ce fragment d’ADN. Pour ce faire, nous réalisons une PCR (Polymerase Chain Reaction). Cette technique nécessite le fragment d’ADN à amplifier et les amorces qui la bornent. Ainsi, dans des microtubes de 0,2mL nous préparons le mix PCR (les valeurs seront données en concentration) :

• 0,2mM de dNTP : nécessaire à l’amplification, ce sont des briques de bases pour la synthèse des brins d’ADN.
• 1X de Tampon PCR : optimise l’activité de la Taq polymérase, elle a un pH et une concentration de sel optimale pour cette enzyme.
• 1,5mM de MgCl2 : cofacteurs de la Taq polymérase, elle a besoin de ces ions pour fonctionner. De plus, pour faciliter l’hybridation, le Mg2+ va venir neutraliser les charges négatives des brins d’ADN afin qu’ils se repoussent moins.
• 1µL d’ADN génomique : sert de matrice à la Taq qui va la copier.
• H2O UP : eau ultra pure – stérilisée – afin de ne pas amener d’autre matériel génétique que l’eau normale ou distillée pourrait.
• 1,25 U de Taq : assure la synthèse des nouveaux brins.
• 0,5µM d’amorce M3A
• 0,5µM d’amorce M3B : assurent la spécificité de l’amplification, de plus, elles fournissent les 3’OH libres pour l’enzyme Taq polymérase

        De plus, il nous faut prévoir un témoin négatif où l’ADN génomique sera remplacé par de l’H2O UP : le résultat attendu est une absence d’amplification puisqu’il n’y a pas d’ADN. S’il y a amplification, c’est que l’un des ingrédients contient probablement de l’ADN génomique.

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