Étude de la malate déshydrogénase (MDH)

Evain Lucas

Hattab Maxime

G5 CB

Étude de la malate déshydrogénase (MDH)

Introduction :

La malate déshydrogénase (MDH) est une enzyme multimérique présente dans toutes les cellules d’organismes vivants. La MDH est présente sous 2 formes : cytoplasmique et mitochondriale et/ou chloroplastique. Dans les cellules eucaryotes, on retrouve la MDH au niveau du cycle de Krebs, où elle catalyse l’inter convection de l’oxaloacétate en L-malate, grâce à la réduction du NADH en NAD+. Cette réaction est importante dans le métabolisme cellulaire car le L-malate est un intermédiaire du cycle de Krebs (dans les cellules animales). Cette réaction est réversible, ce qui signifie qu’il existe un équilibre entre l’oxaloacétate, NADH, H+ et le L-malate, NAD+.

[pic 1]

Méthode

Le TP s’est déroulé en 3 parties. Dans un premier temps nous avons extrait la MDH (ainsi que d’autres enzymes) à partir de feuilles d’épinards que nous avons broyés. La MDH ainsi que les autres enzymes ont pu être extraite grâce à un tampon d’extraction. Après 2 centrifugations à 10 000 rpm, en présence du tampon d’extraction Tris HCl, nous avons obtenu un extrait enzymatique contenant notre MDH (et d’autres enzymes). C’est cet extrait qui nous permettra de déterminer l’activité spécifique de la MDH dans la troisième partie du protocole. Dans un second temps, nous avons préparé une gamme étalon à partir d’une solution de protéine de référence : la sérum albumine bovine (BSA). La préparation de la gamme étalon a été réalisée par une série de dilutions au 1/2, à partir d’une solution de BSA une concentration de 1mg/mL. Cette solution, ainsi que nos dilutions d’extrait, étant incolore, nous avons dû préparer un réactif, le réactif de Bradford, qui absorbe à 595 nm et qui nous permet de déterminer précisément la concentration en protéines dans une solution. Une fois la concentration en enzyme déterminée, nous avons pu passer à la troisième et dernière étape du protocole, la détermination de l’activité spécifique de la MDH de notre extrait.

          Graphe courbe étalon :

Nous sommes montés au 4ème étage pour lire les résultats d’absorbance et tracer notre courbe étalon, et qui nous permettra de déterminer par une simple équation la concentration en enzyme dans l’extrait préparé lors de la première partie du TP.

[pic 2]

La dernière cellule de la 3e colonne correspond à la résolution d’équation où l’on a isolé le x en prenant une absorbance d’un de nos échantillons purs dilué au 1/10. Nous avons eu un petit souci pour les 2 dernières dilutions nous avons fait une 2 fois un une dilution au 1/10 malgré que nos calculs eussent été validé par le professeur surement dû à une erreur de manipulation avec les pro-pipettes de notre part. A l’aide de cette courbe étalon on peut va pouvoir interpréter la concentration en enzyme dans notre extrait préparé au près à l’able. Après résolution de notre équation on tombe sur une concentration de 163,9375 mg/mL sachant que l’on a fait une dilution au 1/10 la concentration est de 1639,375 mg/mL valeur fausse car on devait se rapprocher de notre 1000 mg/mL qui est la concentration de base de notre BSA.

            Nous allons vous expliquer une expérience type réalisée pendant le TP. Cette expérience a été réalisée dans la troisième partie du protocole. Il s’agissait de déterminer l’activité spécifique de l’enzyme extraite dans la première partie de l’expérience, en la mettant en contact avec de l’oxaloacétate et du NADH. L’activité a été mesurée par colorimétrie grâce à un spectrophotomètre, réglé pour envoyer une lumière de longueur d’onde égale à 340 nm, pour observer la disparition du NADH.

II.a) Mesure de l’activité (a) expérimentale de la MDH dans l’extrait protéique

Afin de mesurer l’activité spécifique de la MDH nous réalisons 4 mesures d’activité : ½ qE, qE, 1,5 qEet 2 qE. Pour ce faire il faut utiliser le qE calculer et vérifier si l’on observe bien une variation de 0.1 DO/min.

[pic 3]Données présentant la variation de DO avec 16 µL d’extrait dans la cuve.

On obtient une variation de DO égale à 0.0589, soit environ la moitié de ce qui est souhaité, 16 µL correspond donc à 1/2 Qe. Pour la suite des expériences nous prendrons donc Qe=32 µL, si la DO varie de 0.1 par minute nous pourrons continuer l’expérience avec 1.5 Qe et 2 Qe.

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