La PCR -Plymérase Chaine Reaction

La PCR -Plymérase Chaine Reaction- est une technique de réplication cibée in vitro.Elle permet d'obtenir à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d’importantes quantités d'ADN spécifique et de longueur définie

Le principe et les conditions expérimentales qui en découlent sont très simples. Il s'agit de réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN. Chaque réaction met en œuvre deux amorces oligonucléotidiques dont les extrémités 3' pointent l'une vers l'autre. Les amorces définissent alors, en la bornant, la séquence à amplifier.

L'astuce consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrices pour les étapes suivantes, au lieu de les séparer afin de ne réutiliser que la matrice originale. Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est exponentielle.

Mutagenèse dirigée : consiste à créer artificiellement in vitro des mutations dans une sequence d'ADN, et choisir eventuellement leurs effets :

création de la mutation in vitro

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introduction du fragment d'ADN mutant dans la cellule

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criblage des transformants et vérification de la fonctionnalité de l'ADN mutant introduit

durant ce TP nous allons mettre en avant la technique de la PCR et de la mutagenèse ciblée, en introduisant une mutation ponctuel dans la séquence d'ADNc de la DsRedT3, qu'on produira par la suite dans des bactéries qu'on mettra en culture.

on mettra également en évidence la méthylation de l'ADN, qui est un mécanisme d'ajout d'un groupement méthyle sur une base,dont le rôle est impliqué dans le premier niveau d'expression des gènes, de ce fait, plus la méthylation est faible plus la transcription est forte.

Dans un premier temps nous allons faire une mutagenèse dirigée par PCR chevauchante de la DsRed, la PCR est faite par les amorces Forward et Reverse.ici on connais l'acide aminé qu'on va modifier,à la position de l'acide aminé 42 AAC→CAG on a changer 2 nucléotides, pour passer de l'acide aminé Q à l'acide aminé N.

Ensuite on effectue une digestion du produit de PCR par du DpN1 : à la fin du cycle de PCR on a la matrice sauvage, on fait une digestion par DpN1 pour digérer l'ADN parental qui va etre méthylé et laisse l'ADN amplifié par PCR qui est non methylé.

Enfin, on effectue une transformation bactérienne, en insérant l'ADN muté dans le génome des bactéries, et on les met en culture dans des boites de pétrie.

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