L’UHPLC et les types de colonnes utilisés

Sommaire :

a)INTRODUCTION. 2

b)MATERIELS ET METHODES. 2

b.1.L’UHPLC et les types de colonnes utilisés. 2

b.1.1.Principe de l’UHPLC. 2

b.1.2.Colonnes core-shell et colonnes poreuses. 4

b.2.Préparations des échantillons et des phases mobiles. 4

b.3.Logiciel de plan d’expérience : Fusion AE™. 5

b.4.Etude de l’oligosaccharide thérapeutique. 5

b.4.1.Plan d’expériences A 6

b.4.2.Plan d’expériences B 7

b.4.3.Plan d’expériences C 8

b.4.4.Plan d’expériences D 9

b.4.5.Plan d’expériences E 10

b.4.6.Plans d’expériences F 11

c)Plan avec BHE/Acétonitrile 11

d)Plan avec Kinetex PFP/Méthanol 11

d.1.1.Plan d’expériences G 12

e)DISCUSSION 13

a) INTRODUCTION.

Pharmaphysic est un laboratoire de sous-traitance spécialisé dans la prestation de services d’analyse pour des industries pharmaceutiques et cosmétiques. Ce laboratoire est principalement spécialisé dans le développement et la validation de méthodes d’analyse, l’étude de stabilité, l’investigation « sur non-conformité ». Cette entreprise locale possède une installation récente, un laboratoire équipé de nombreux instruments d’analyse (plusieurs chromatographies liquides couplés avec différents détecteurs, plusieurs couplés chromatographies gazeuses avec différents détecteurs, UHPLC, électrophorèse capillaire, spectrophotomètre, et autres). Pharmaphysic met également à la disposition de tous un blog dédié aux techniques d’analyses physico-chimiques, à leurs applications, et à leurs évolutions. Ils y apportent leurs expériences dans le développement et la recherche analytique, et ajoutent des commentaires de publications. A travers ce blog, Pharmaphysic essaie faire partager leurs avancés, certains de leurs travaux, leurs points de vue sur la chimie analytique.

Cette entreprise propose également à leurs clients des formations de quelques jours aux techniques d’analyses, notamment chromatographiques.

Le principal projet de ce stage effectué au sein de cette entreprise est l’analyse de molécules et de produits pharmaceutiques en UHPLC (« Ultra High Performance Liquid Chromatography »). Tout d’abord, une première étude a été de faire l’analyse d’un oligosaccharide thérapeutique (C95H143N11O59S8Na8), qui représente une grosse molécule pour les chimistes et qui est donc difficile à analyser. Cette étude est réalisée pour le compte d’Endotis Pharma, une société biopharmaceutique dédiée à la découverte et au développement d’oligosaccharides de synthèse pour des applications dans le domaine cardiovasculaire. Le principal objectif de cette étude est de rechercher une technique significative, représentative de la qualité du produit. Pour cela, une optimisation de méthode d’analyse a été réalisée, à l’aide d’un logiciel de plan d’expérience. Le comportement de cette molécule ayant déjà été étudié en HPLC (« High Performance Liquid Chromatography »), les résultats obtenus après l’optimisation de la méthode en UHPLC seront comparés à ceux obtenus en HPLC. Les résultats obtenus à l’aide de ses deux techniques d’analyse seront comparés à titre personnel pour Pharmaphysic dans le but d’alimenter le blog de l’entreprise sur les différences de performance entre HPLC et UHPLC.

Et ensuite, une seconde étude de deux composés de « néopentylglycol dipalmitate » a été réalisée pour le compte de Bios Chemicals qui est spécialisé dans la production de molécules (de quelques grammes à plusieurs kilogrammes). Dans un premier temps, cette deuxième étude a pour objectif d’essayer de savoir quel est le produit correspondant au néopentylglycol dipalmitate sur les deux échantillons de Bios Chemicals. Ayant fabriqué un premier produit (lot NP01) en petite quantité correspondant à leur attente et un second produit (lot NP02) en plus grande quantité mais ne correspondant pas pas au premier produit d’un point de vue physique, Bios Chemicals voulait savoir lequel des deux pouvait être le produit souhaité. Ensuite, le second objectif est de quantifier les composés présents dans les deux produits, et de comparer ces résultats pour compléter les premières hypothèses.

La seconde partie du projet est un travail de recherche bibliographique, afin d’alimenter le blog de Pharmaphysic avec des résumés d’articles scientifiques sur de nouvelles techniques de préparation ou sur de nouvelles méthodes d’analyse. Certaines conclusions obtenues, notamment sur les différences de résultats d’une analyse spécifique en HPLC et UHPLC, ou sur la différence de performances entre certaines colonnes chromatographiques, viennent également alimenter le blog dans une optique de partage.

b) MATERIELS ET METHODES.

Les instruments, qui ont été essentiellement utilisés, sont un appareil UHPLC, une ACQUITY UPLC H-Class de la marque Waters™ (figure 1), couplée à un détecteur UV (Ultraviolet - Visible) ; et un appareil HPLC de la marque Agilent™ également couplée à un détecteur UV. Waters™, tout comme Agilent™ sont des entreprises de renommer mondiales qui développent des solutions analytiques innovantes pour aider les laboratoires dans leurs recherches, leurs analyses quotidiennes, et leurs performances. L’exploitation et le pilotage des analyses UHPLC et HPLC ont été réalisés à l’aide du logiciel Empower™. Ce logiciel couplé à l’UHPLC et l’HPLC permet de piloter, et de paramétrer facilement les analyses à effectuer. Lors des analyses en UHPLC et en HPLC, différentes colonnes, appelées core-shell et poreuses, ont été utilisées pour obtenir la meilleure séparation possible des produits étudiés. Lors des deux études, différentes phases mobiles ont été également utilisées pour l’optimisation des méthodes. Pour effectuer les deux études, des méthodes d’analyse ont été créées et optimisées à l’aide d’un logiciel, nommé Fusion AE™, qui permet la création de plans d’expériences.

b.1.

...