Détermination Du Site Actif D'un Peptide Synthétique Par HPLC

Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC

BUT :

Nous allons localiser le site d’interaction d’un peptide synthétique avec un glycosaminoglycane, l’héparine. Nous utiliserons une chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions en HPLC pour analyser le peptide. Puis l’éluat obtenu en chromatographie d’affinité, analysé par HPLC, permettra d’identifier le ou les sous-peptide(s) contenant le site d’interaction avec l’héparine.

PRINCIPE :

La chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions

Il s’agit d’une chromatographie liquide de partage dans laquelle la séparation se fait en fonction de la polarité. En effet, la séparation en chromatographie en phase inverse dépend de l’adsorption réversible de molécules selon leur hydrophobicité dans des conditions où la phase stationnaire est plus hydrophobe que la phase mobile.

Les supports ayant un greffage hydrophobe, les composés non polaires seront retenus. Il est donc nécessaire pour les éluer de diminuer la polarité de la phase mobile en lui ajoutant une substance moins polaire.

Le gel de silice est ainsi rendue hydrophobe en greffant des groupements hydrophobes sur les fonctions silanol présentes à la surface. Soit des silices greffées de chaîne alkyle (octyle ou octadécyle). Pour ce TP nous allons utiliser un greffage octylsilane, soit un greffage de groupes de 8 atomes de carbones, C8.

Nous avons une phase mobile polaire composée de la manière suivante : Solvant A : TFA 0,1% dans de l’eau et le Solvant B : acétonitrile 90%, TFA 0,1%. Nous utilisons le plus souvent un couple de solvant eau/ acétonitrile en phase inverse. C’est un mélange binaire contenant un tampon de pH et le contre ion, qui est le TFA. Le TFA est l’ion de charge opposée à celle des solutés à séparer et capable de former une paire d’ion. Il s’agit d’un appariement d’ions, entité formée par l’association de deux ions de charges opposées. Le contre ion doit comporter une ou plusieurs chaînes hydrophobes de manière à pouvoir interagir avec la phase stationnaire apolaire.

Dans le cas où la phase mobile est très polaire, certaines molécules hydrophobes vont venir se lier avec la phase stationnaire et ainsi être absorbées. Il s’agit de l’étape de fixation.

Ainsi, les peptides contractant le moins d’interactions hydrophobes avec la phase stationnaire sortiront avant ceux comportant plus de résidus apolaires dans leur séquence.

La différence d’hydrophobicité est la base de la séparation. Alors une diminution de la polarité de la phase mobile va entrainer une diminution des interactions hydrophobes. Il s’agit de l’étape de séparation.

Nous avons réalisé un gradient d’élution, car la meilleure force d’élution pour le début de l’analyse n’est pas forcément adaptée pour une bonne séparation des solutés sortant en fin de chromatogramme.

L’HPLC :

L’HPLC permet la séparation ou la purification d’un ou de plusieurs composés d’un mélange en vue de leur identification et de leur quantification.

Les composés à séparer sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide. Selon la nature des molécules, elles se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire.

La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique.

Pour ce TP nous allons injecter un peptide qui va être transporté au travers du système chromatographique. En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés par un pic. Les différents constituants de cet appareillage HPLC sont :

Réservoir de la phase mobile

Le plus souvent ce réservoir est une bouteille en verre dans lequel plonge un tube avec une extrémité filtrante. Ces réservoirs sont souvent étanches afin d’éviter l’évaporation des solvants (et ainsi la modification de la composition du mélange) ou leur contamination.

S’il est nécessaire le dégazage peut se faire par agitation puis conservation du solvant sous atmosphère d’hélium.

Pompe

La pompe d’un chromatographe a pour rôle d’assurer l’écoulement de la phase mobile dans la colonne.

Les pompes doivent être très puissantes car certains solvants peuvent être visqueux et la granulométrie étant très fine, des phases stationnaires entraînent des différences de pression ou des pertes de charges entre le sommet et l’extrémité des colonnes qui peuvent parfois être importantes (50 à 100 bars). C’est pourquoi il ne faut pas que les solvants ne doivent pas être visqueux.

Elle est définit par la pression qu’elle permet d’atteindre dans la colonne, son débit, et la stabilité du flux.

Injecteur

L’échantillon est introduit avec une seringue à la pression atmosphérique dans la boucle (position chargement ou load), puis il est mis en communication par rotation de la vanne avec la phase mobile et la colonne (position inject).

Détecteurs

Le détecteur suit en continu l’apparition des solutés. Le signal obtenu est enregistré en fonction du temps.

Définition du temps de rétention d’un composé : le temps écoulé entre l’introduction du composé dans la colonne et le moment où il sort à sa concentration maximale. Il correspond au temps de séjour d’un soluté dans la colonne.

PROTOCOLE :

Colonne utilisée : Au cours de ce TP la phase stationnaire en silice a une granulométrie de 7µ, entièrement poreuse (porosité de 300 angströms), un greffage C8 et des dimensions de 3cm ×2,1 mm.

Débit : 1ml/min

La nature de phase mobile : mélange de solvant, acétonitrile et eau, la phase est donc polaire

Programme de gradient utilisé : C’est un programme de gradient linéaire de l’acétonitrile. L’élution graduée lors de la séparation de mélanges complexes permet, en modifiant la composition de l’éluant, d’optimiser les facteurs de capacité et de réduire les temps d’analyse.

Détection : Elle a lieu à une longueur d’onde de

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