Compartiments de la cellules et sécrétions des protéines Etude de l’activité des MMPs gélatinases

Compartiments de la cellules et sécrétions des protéines

Etude de l’activité des MMPs gélatinases

Introduction et but du TP

La matrice extracellulaire (MEC) correspond à un ensemble de macromolécules extracellulaires sécrétées localement par les cellules d’un tissu et organisé en un réseau autour de ces dernières. La MEC, essentiellement fabriquée par les fibroblastes, est en renouvellement constant c’est-à-dire qu’à l’état physiologique et homéostatique, il y a autant de production que de destruction matricielle.

Les métalloprotéases matricielles (MMP) sont des enzymes, des protéases à zinc ayant un rôle dans la modification de la MEC ; ou plus exactement dans la dégradation protéolytique de nombreuses protéines de la MEC permettant le remaniement, le remodelage de celle-ci.

Dans ce TP, nous allons étudier l’expression, la sécrétion et surtout l’activité des MMP’s gélatinases, c’est-à-dire MMP-2 et MMP-9. Nous allons étudier cela à travers une électrophorèse SDS-PAGE et une zymographie sur gel de gélatine après traitement de fibroblastes en culture au cycloheximide et à la colchicine.

Matériels et méthodes

Nous voulons étudier l’expression, la sécrétion et l’activité des MMP-2 et MMP-9. Pour cela des fibroblastes HTK sont cultivés dans leur milieu de culture complet en présence de cycloheximide ou bien de colchicine, avec un témoin non traités dans chaque cas. Nous utilisons des fibroblastes car ils ont un rôle de sécrétion de MMP lors de la synthétisation de la MEC. Nous utilisons la cycloheximide et la colchicine pour leurs caractéristiques évoquées dans le polycopié du TP.

Nous réalisons par la suite deux gels : un pour l’électrophorèse SDS-PAGE et un second pour l’électrophorèse SDS-PAGE suivie d’une zymographie sur gel de gélatine. Chaque gel est composé de deux partie distincte : un gel de concentration - 4% - (située en haut du gel de séparation et permettant une entrée homogène des échantillon dans le gel de séparation) et un gel de séparation - 10% - (dans lequel les protéines vont migrer selon leur poids moléculaire).

Ces gels sont composé d’acrylamide, H2O, SDS, Gélatine, APS, TEMED et tampon.

Le gel SDS-PAGE servira à analyser et à séparer, dans un gel polyacrylamides dans un champs électrique, des protéines - en fonction de leurs poids moléculaire - du lysat cellulaire (protéines intracellulaires - qui sert à observer la quantité de protéines) et du sécrétome (protéines sécrétées par les fibroblastes - qui sert à étudier l’activité enzymatique des MMPs) des fibroblastes. Il y a coloration au bleu de coomassie. Cette méthode permet l’observation de la quantité totale des protéines dans les cellules. Cela permet d’étudier leurs synthèses et suivre l’expression, l’activité des MMP.

Le gel de zymographie contient de la gélatine incorporée dans un gel polyacrylamide qui sera digérée par les MMP. Cette dégradation sera visible après migration, renaturation des protéines (qui ont été dénaturées par SDS auparavant) et restauration de l’activité des protéines par un bain de Triton (qui est un détergent qui va déplacer le SDS) car l’activité MMP dépend du calcium. La gélatine est donc dégradée. Naturellement les protéines vont reprendre leurs structures. Il y a ensuite une coloration au bleu de coomassie.

Pour la zymographie le gel sera bleu avec des bandes blanches aux endroits où la gélatinase active aura dégradé la gélatine : c’est une analyse qualitative de l’activité des MMP. Pour obtenir une analyse quantitative, on analysera le gel à l’aide d’un système d’analyse d’image par comparaison à des bandes témoins. Au contraire, pour le SDS-PAGE, les bandes seront colorées et non le gel.

Résultats zymographie et gel SDS-PAGE

1 - Dosage des protéines

Voir la courbe étalon BSA en annexe 1 et les calculs et explications en

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