Partiel Biochimie-Réactions Cellulaires

UNIVERSITE AIX-MARSEILLE[pic 1]

Licences Sciences et Technologies-mention SV - L2S3

Partiel Biochimie-Réactions Cellulaires - 4 novembre 2014

Durée : 2 heures        Aucun document n’est autorisé

Deux parties à rendre sur des copies séparées

1ère partie: Métabolisme. Durée estimée 45 minutes ; points: 7

Question n°1        (3 points)

Citez 3 exemples de voies métaboliques. Pour chacune de ces voies, vous précisez le(s) métabolite(s) de départ et d'arrivée, sa finalité principale, comment cette voie s'intègre dans le métabolisme général de la cellule et sa régulation éventuelle. Vous préciserez également les liens éventuels (métabolites communs, régulation, localisation…) qui relient les 3 exemples que vous avez choisis.

Voir cours pour les exemples et les détails.

Question n°2        (3 points)

Les valeurs de ΔG°’ et de ΔG’ dans les cellules ont été déterminées pour de nombreuses réactions métaboliques différentes.

        a) Que signifie le prime ( ’ ) sur ΔG°’ ?

        b) Quelle est la différence entre ΔG°’ et de ΔG’ ?

        c) Quelles informations ces valeurs apportent-elle concernant ces réactions ?

a) La variation d’enthalpie libre standard (ΔG°) correspond à la différence d'énergie entre les produits de la réaction et les réactifs dans les conditions standard (T = 25°C (298K), P = 1 atm, concentrations initiales = 1 mol/l). Cette dernière condition ne convient pas pour un biochimiste car elle doit aussi être respectée pour le proton H+ qui participe à de nombreuses réactions en biochimie. Or, dans ces conditions pH = 0, ce qui évidemment ne reflète pas la réalité cellulaire puisque le pH est le plus souvent proche de 7 ([H+] = 107 mol/l). De même, la molécule d'eau (H2O) participe, elle aussi, à de nombreuses réactions qui ont lieu en milieu aqueux où [H2O] = 55,5 mol/l et non 1 mol/l. Par conséquent, en biochimie on utilise des conditions standard différentes qui tiennent compte de [H+] = 107 mol/l et [H2O] = 55,5 mol/l. On parlera dans ce cas d’enthalpie libre standard modifiée (ΔG°’).

b) ΔG°’ est la variation d’enthalpie libre standard. L’enthalpie libre réactionnelle (ΔG') tient quant à elle compte des conditions particulières de la réaction (température, concentrations des réactants, pression éventuellement). 

ΔG' = ΔG°' + RT ln ([C] x [D] / [A] x [B])

c) La variation d’enthalpie est très utile car elle permet de prévoir, à un instant t, l’évolution de la réaction d’un point de vue quantitatif dans les conditions standard ou en fonction des conditions de la réaction.

Si ΔG' (ou ΔG°') = 0, le système se trouve dans un état d’équilibre.

Si ΔG' (ou ΔG°') < 0, la réaction est dite exergonique (elle est spontanée) car elle sera capable de fournir un travail (du grec ergo, travail).

Si ΔG (ou ΔG°')' > 0, la réaction est dite endergonique car on devra fournir du travail pour qu’elle ait lieu (elle n’est pas spontanée).

Question n°3        (1 point)

En l’absence d’oxygène, les cellules de levure consomment du glucose à une vitesse élevée et constante. Quand de l’oxygène est ajouté, la consommation de glucose diminue précipitamment et est alors maintenue à une faible vitesse. Pourquoi le glucose est-il consommé rapidement en l’absence d’oxygène et lentement en sa présence ?

En absence d’oxygène, la dégradation d’une molécule de glucose en éthanol + CO2 permet la production nette de 2 molécules d’ATP. En présence d’oxygène le glucose est entièrement dégradé en CO2 + H2O puisque la chaîne respiratoire fonctionne, ce qui permet d’utiliser plus efficacement le glucose. On a, dans ce cas, production nette de 36 molécules d’ATP. Par conséquent la consommation de glucose diminuera si des levures cultivées en anaérobiose sont exposées à l’oxygène.

2ème partie: Protéines et stratégie d'étude. Durée estimée : 1h15; points : 13

Etude de la Disulfide bond protein (Dsb) de Wolbachia pipientis: La formation des ponts disulfures est une étape cruciale dans le repliement des protéines. Chez les bactéries gram négatif, cette étape est catalysée dans le périplasme par une enzyme appelée la disulfide bond protein A (DsbA1). Nous nous proposons d’étudier cette protéine issue de Wolbachia pipientis (α-DsbA1, 25,4kDa). (Kurz et al, protein expression and purification, 2008)

1. Purification de la α-DsbA1 produite chez E.coli

Le gène codant pour la α-DsbA1 de W. pipientis a été cloné et exprimé chez E. coli. La protéine α-DsbA1 de W. pipientis est ensuite purifiée à partir d’un extrait brut d’E. coli exprimant cette protéine recombinante, selon le protocole adapté décrit dans le tableau 1.

Tableau 1: bilan de purification de α- DsbA1

Les fractions purifiées sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (figure 1).

A                B

 1    2    3           1    2   3    4        

[pic 2][pic 3][pic 4]

Questions :

        1a. Donner le principe des deux chromatographies utilisées : échangeur de cations et exclusion.

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