L'élongation de l'ADN

Il faut tout d’abord procédé à la dénaturation, c’est-à-dire la séparation de l’ADN, constitué d’une double hélice, en deux simples brins. Cette séparation doit se faire à une température tournant autour des 90 °C afin de briser les liaisons hydrogènes qui lit le double brin de l’ADN et ainsi le séparer en deux brins simples.

On passe par la suite à l’hybridation, lors de laquelle il faut refroidir le mélange pour ainsi l’amener à une température se situant entre 40 et 65 °C. Ce refroidissement est essentiel car il permet aux liaisons hydrogènes des brins d’ADN de se reformer mais, à la place de les relier entre eux pour en faire à nouveau un double brin, les brins simples vont se lier avec les amorces qui se fixeront au début et à la fin des segments d’ADN que l’on veut analyser grâce à la complémentarité des bases azotées qui les constituent. L’amorce liée au début de la séquence d’ADN à répliquer sera donc « l’amorce début » et celle à la fin, « l’amorce fin ».

Il est possible de passer par la suite à l’élongation. Celle-ci est possible grâce à l’ADN polymérase Taq qui est une enzyme extraite de la bactérie Thermophilus aquaticus vivant dans des sources thermales. Cette enzyme a pour avantage sa capacité à fonctionner même à des températures extrêmement élevées, mais n’est efficace qu’au dessus du seuil des 70 °C, raison pour laquelle cette partie de l’expérimentation doit absolument se faire à une température minimale de 70 °C. Cet ADN polymérase va donc se fixer à « l’amorce début » et commencer sa synthétisation de l’ADN à partir de celle-ci. Il est aussi important de spécifié que « l’amorce début » diffère de l’ADN que l’on désir répliquer au niveau de la mutation 145. L’amorce possède une base azotée G plutôt que A. Ainsi, les copies de l’ADN produites par l’ADN polymérase présenteront une base azotée G plutôt que A à ce niveau. Cette particularité sera très importante au niveau de la digestion de l’ADN.

Ce cycle en trois étapes doit être répéter une trentaine de fois afin de permettre la création d’un maximum de copies possibles.

Digestion de l’ADN

La digestion de l’ADN copié a pour but de couper les allèles goûteur en deux et de laisser les allèles non gouteurs intactes pour pouvoir les distinguer les une des autres.

Dans ce but, l’ADN issus de l’amplification (réplicons) est mélangé avec l’enzyme de restriction HaeIII. Cet enzyme a pour particularité d’être en mesure de couper un brin d’ADN au niveau d’une séquence de bases azotées GGCC, séquence présente sur l’allèle goûteur grâce à la légère modification qu’apportait l’amorce début dans la phase d’élongation lors de l’amplification de l’ADN. Cette modification va aussi avoir un effet sur la séquence de l’allèle non goûteur qui se verra transformer en GGGC mais l’enzyme HaeIII ne coupant qu’à la séquence GGCC, l’allèle ne sera pas coupé par l’enzyme.

La digestion des réplicons à l’aide de l’enzyme HaeIII doit se faire à une température avoisinent les 37°C car à température trop forte ou trop élevée, il devient inactif.

À ce niveau de l’expérience, il est aussi important de garder une partie de l’ADN amplifié sans enzyme

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