Technique et analyse d'image

                                                  Technique d'analyse d'image

Fluorophore

Le marquage s'effectue en général à l'aide d'ac, couplé a un fluorophore.

On utilise un ac primaire dirigé vs la molécule cible puis un ac secondaire couplé a un fluorophore vs le ac primaire .

Le marquage peut aussi se faire par fusion transcriptionnelle ou traductionnelle ( gene rapporteur GFP)

Ou également par hybridation d'une sonde complémentaire a la séquence cible couplé d'un fluorophore

Cameras, capteurs

certaine microscopes moderne sont équipés d 'une ou pls cameras capable d'enregistrer des images ou séquences vidéo .

Un miroir permet d'envoyer l'image vers l’œil ou vers la cameras .

En Microscope cofocal

l’échantillon est balayé et illuminé point par point par un laser focalisé

L'image est recueillie par un détecteur soit / par un photodiode à avalanche / ou PMT

étape de détection des photons , de conversion en électrons puis de transfert vers l'ordinateur et traitement électronique sont pas parfaites ( bruit de fond) qui se superpose au signal mesuré

Taille pixel et résolution

un capteur numérique est composé d'un quadrillage de photosites qui transforme un signal lumineux ( photon) en signal électrique (électrons) ce qui me donne des pixels

ex un capteur carré de 10 mm de diagonal utilisé avec un objectif 40x permet d'observer une region de 250 micrometre en diagonale au niv de échantillonnage

paramètre concernant : la résolution

des pixels très larges donneront une image avec peu de signal

des pixels trop petits donneront un signal faible

rappel la limite de diffraction ( d’après le critère de Rayleigh) : =0,61 lambda/NA

Pour enregistrer toute l'information d'un signal au cours de sa numérisation il faut que la résolution d sup ou egale a la ½ de la limite de résolution ( ce qui fait environ 100 nm en optique)

Niv de échantillonnage

La taille des pixels c'est la numérisation donc l' échantillonnage spatial de l'image

Autre paramètre est la numérisation donc échantillonnage du signal

l'intensité de chaque pixel est codée sous la forme d'un nombre

les capteurs codent les informations sur des nombres binaires de 8 bits

 codage entre 00000000 et 11111111 = 2^8-1=255     2^n-1        n = nbr de bits

image en couleur composés de 3 composantes RVB    

• 255^3 combinaisons
• 8 x 3 =24 bits

Les capteurs scientifiques codent sur la base de 16 bits , soit 2^16-1=65536

Une image 16 bits utilise deux fois plus de mémoire , donc de place de stockage et de temps d'enregistrement et de lecture mais elle contient potentiellement plus d'information.

Rapport signal/bruit ( RBS)

Tout signal contient des imperfections

• RBS élevé , signal Haute qualité
• Rbs bas, signal très faible

RBS= 10Log10(Ps/Pb) en Bels          et si on veut en décibel (dB) on multiplie par 10

RBS= 20Log10(Is/Ib) en dB ( RBS en fonction de l'intensité)

les différentes origines du bruit

signal lumineux                       signal électrique qui est amplifié                convertie en donné numérique[pic 1][pic 2]

• – photosites ( pixel) du capteur                             – convertisseur

Bruit photonique

propriété quantique de la lumière : c'est le fait que les photons n'arrivent pas tous en même temps sur les photosites

• ce bruit diminue avec l'intensité lumineuse et le temps d'exposition
• le bruit et inv proportionnelle a la taille des pixels

un petit pixel récolte moins de photons qu'un grand pixel donc il est plus sensible au bruit

c'est la principale source de bruit

d'autre cause de bruit

• structurel permanent du au différentes réponses des photosites a la lumière donc DEPEND de la Qualité du capteur
• de lecture et courant noir bruit de lecture peut apparaître lors de la phase de la transformation du signal lumineux en électrique , certain électron peuvent se perdre

courant noir car même en absence d'un signal lumineux un faible signal électrique est généré

• d'amplification lors de l'amplification en électrons

type de bruit sont sensible a la température , il augmente avec la température

il y a aussi le bruit de quantification qui apparaît lorsque le signal électrique est transformé en information numérique . Le bruit diminue quand les bits augmentent

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