Immunohistochimie appliquée à la biologie

Dr Laurent Livie Kandler 10/02/2022 16h - 18h

Immunohistochimie appliquée à la biologie : Nouveautés et couplage aux techniques d’analyse des acides nucléiques, TMA, Thérapie ciblée

I- Immunodétection sur coupes tissulaires :

A - Principe de l'IHC :

La technique d'immunohistochimie (IHC) utilise un anticorps primaire pour révéler une molécule localisée soit au niveau de la membrane cellulaire, soit dans le cytoplasme (enzymes, glycoprotéines, produits de sécrétion), soit dans le noyau (facteurs de transcriptions). L’anticorps primaire est ensuite révélé.

NB : un anticorps donné ne définie pas toujours un seul type cellulaire.
Exemple : un anticorps anti-CD34 reconnaîtra des progéniteurs hématopoïétiques, mais également des cellules endothéliales.

Les différentes méthodes de révélation en IHC : 
- Méthode directe : l'anticorps marqué reconnaît sa molécule cible, le signal est faible, nécessité de l’amplifier. Technique utilisée surtout sur les cellules, peut sur les tissus, car résultats plus aléatoire (à cause du formol qui forme des liaisons entre les protéines qu’il est nécessaire de casser).

- Méthode indirecte : l'anticorps primaire est dirigé contre la molécule cible, et c'est un anticorps secondaire qui est marqué et qui va révéler la fixation de l'anticorps primaire. Permet d'amplifier le marquage (plusieurs anticorps secondaires se fixent sur l'anticorps primaire, augmente le marquage, permet l’amplification).

- Méthode PAP : l'anticorps primaire est dirigé contre la molécule cible, un anticorps secondaire sur fixe sur l'anticorps primaire, la fixation est révélée par un complexe avec plusieurs anticorps qui sont biotinylés (péroxydase-anti-peroxydase). La plus couramment utilisé dans les machines.

Quand on cherche à marquer une protéine, on va sélectionner un anticorps parmis les différents anticorps disponibles à son encontre selon les critères suivants : affinité pour la protéine, et surtout : fonctionnement de l'anticorps en paraffine.

B - Principales techniques : 1 - Streptavidine-Biotine-peroxydase : 1. Anticorps primaire (monoclonal ou polyclonal) : on prend un anti-sérum de lapin, des anticorps primaires vont se fixer à la surface de la cellule contre l’Ag de la protéine, dont certains sur notre molécule d’intérêt. 
2. Lavage : après lavage il reste uniquement les anticorps primaires qui nous intéressent (fixés à la molécule d’intérêt).

3. Anti-sérum de chèvre anti-Igs lapin biotinylés : on met un anti-sérum d'un animal différent (ici chèvre) qui contient des anticorps qui vont reconnaître le fragment Fc de notre anticorps primaire de lapin. Cet anti-sérum est biotinylé, cela va permettre la révélation par le complexe streptavidine-biotine-peroxydase (SBP)

4. Lavage 
5. Complexes streptavidine-biotine-peroxydase : le peroxydase réagit avec les éléments tyrosine de la biotine qui est fixée sur l'anticorps secondaire de chèvre 
6. Révélation de l'activité enzymatique (H202+DAB (DiAminoBenzidine)): cette réaction enzymatique permet la révélation du complexe SBP, cela donne un précipité de couleur marron.

Au final, grace à cette technique, à l'endroit où l'anticorps primaire s'est fixé, on va avoir une amplification par l'anticorps secondaire puis une révélation par le complexe SBP ce qui donnera un marquage marron.
Cette technique streptavidine-biotine-peroxydase montre bien la fixation et la localisation de l'anticorps primaire. C'est la technique classique d'immunohistochimie.

A la place de la peroxydase (marquage marron), on peut utiliser de la phosphatase alcaline (marquage rouge).

2 - HIS et multi-marquage : 
On peut utiliser le même système mais cette fois pour révéler des ARN. C’est ici une sonde d’intérêt qui est mise en évidence, tout comme une protéine ou un épitope.

Principale application : détection de chaînes légères Kappa/Lambda. Met en évidence la présence des ARNm codant pour les chaînes légères IgK et IgL. Arme diagnostique pour le lymphome.

Exemple : sonde EBER : c'est un ARN ribosomial qui appartient au virus HBV (papillomavirus). On peut aussi utiliser ce système pour faire de multiples marquages en même temps (5-6 marquages maximum). 
Exemple : CD20-CD3 : au lieu de faire marquage par marquage, on peut faire un double marquage pour voir la proportion des différentes sous populations de cellules.

Exemple : CD20-CD8-CD173 : triple marquage.

C - Antigène et épitope :

Transcriptome = ensemble de gènes transits en même temps dans une cellule. Avec un anticorps on peut détecter plusieurs épitopes qui définissent une localisation dans la cellules.
Ces épitopes peuvent être de type :

Protéines : continue (l'anticorps est dirigé contre des acides aminés qui sont les uns à côté des autres), discontinue ( cause de la conformation 3D de la protéine, attention à la dénaturation (spécialement le formol et la paraffine, d'où l'importance de vérifier si l'anticorps fonctionne en paraffine)). - Polysaccharides : glycoprotéines - Lipidiques : lipoprotéines
- Acides nucléiques

D - Anticorps monoclonaux/polyclonaux :

Les anticorps monoclonaux reconnaissent un seul épitope d'un antigène : plus spécifiques.
Les anticorps polyclonaux reconnaissent plusieurs épitopes d'un antigène : moins spécifiques, plus sensibles.

Illustration :
Protéine avec plusieurs épitopes, 3 anticorps reconnaissent différents épitopes de la même protéine, ce sont des anticorps polyclonaux.

Pour produire un anticorps polyclonal : on immunise l'animal avec un sérum ou protéine d'intérêt, cet animal produit des anticorps que l'on va récupérer puis on pourra dire que ces anticorps produits reconnaissent notre protéine donnée (la production par immunisation est assez facile).

Pour produire un anticorps monoclonal : on immunise l'animal par une protéine ou molécule d’intérêt, puis on récupère les cellules de la rate (splénocytes) de l'animal qu'on fusionne ensuite avec un myélome (cellule cancéreuse de plasmocyte

...