Séquençage d'ADN

La synthèse d’un brin matrice par une ADN polymérase est initiée par la fixation d’une amorce spécifique, complémentaire du brin matrice. Cette ADN polymérase va permettre l’élongation d’un nouveau brin complémentaire du brin matrice dans le sens 5’ 3’

L’ADN polymérase va permettre la fixation de dNTP par la formation d’un pont phosphodiester entre le 3’OH de la chaîne et le 5’ phosphate du dNTP suivant.

La réaction de Sanger repose sur la fixation aléatoire par cette ADN polymérase de ddNTP eux aussi présents dans le milieu réactionnel. Ces ddNTP diffèrent des dNTP par leur extrémité 3’. L’extrémité 3’OH des dNTP est remplacée par une extrémité 3’H.

Cette modification empêche la formation de la liaison phosphodiester entre le ddNTP fixer dans la chaîne et le nucléotide suivant. Alors l'allongement de la chaîne est alors interrompu.

. L’identification du ddNTP présent à l’extrémité 3’ de chaque fragment déterminera la séquence nucléotidique du brin matrice initial

.L’élongation de chaque monobrin se termine par l’incorporation d’un DDNTP qui est marque par un Fluorochrome différent dont le spectre d’émission est spécifique. Grâce a une analyse spectrale des différents Fluorochrome associes a une base correspondante et donc définir la séquence nucléotidique du brin d’ADN initiale

Un système de transfert d’énergie par résonance entre deux Fluorochrome qui sont fixer sur un même DDNTP

Ces deux Fluorochrome différent par leur fonction on a :

La fluorescéine qui est le Fluorochrome donneur commun a tous les DDNTP

La diclhororhodamine qui est le Fluorochrome receveur qui est propre a chaque DDNTP

Tout d’abord le rayon laser excite le Fluorochrome donneur ensuite cette fluorescence est capter par le Fluorochrome receveur qui est a son tour excite et donc celui-ci va émettre une fluorescence spécifique a chaque DDNTP

Une électrophorèse est effectué dans des tubes capillaires de verre va permettre de séparer les produit de la réaction de séquence. Les capillaire auquel est associes une électrode vont être plonges dans les échantillons une électro injection permet d'introduire l’ADN seul dans le polymère Après cette injection l’électrode accompagner du capillaire vont être plongé dans une solution de tampon

Les fragments d’ADN charges négativement vont être séparé selon leur taille par électrophorèse. La migration s’effectue à l’aide d’un polymère (pop7) c’est une matrice de séparation permettant d’effectuer le séquençage d’ADN et l’analyse des fragments sur les analyseurs génétiques

Lorsque les fragments arrivent au niveau de la fenêtre en quartz du capillaire le Fluorochrome qu'ils portent est exciter par le laser et la fluorescence émise est capturer par une camera

La camera convertit la fluorescence émise par le Fluorochrome en signal électrique qui est transféré à l'ordinateur

L'ordinateur construit un électrophore-gramme chaque pic de couleur spécifique a 1 base

L’analyse

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