Méthodes d'exploration

Méthodes d’exploration

MICROSCOPIE

1. microscopie photonique

2. microscopie électronique (10 et 100 nm)

échelle logarithmique

unités habituelles

micron: 10^-6 m

nano: 10^-9 m

A°: 10^-10 m

photonique on ne voit pas les virus et structure intracell

taille de la cellule : 10-20 micron

A contraste de phase: photonique et permet de voir les cell vivantes (image: points: cellules)

= microscope a lumiere blanche + système optique particulier

pouvoir de resolution en lumière blanche (>0,2 micron)

autres systèmes permettant de voir les cellules vivantes (contraste d’interference differentielle, a fond noir) cellules: 70% d’eau donc transparent donc il suffit d’équiper avec un système qui permet de voir la fluorescence

microscope photonique: coups autour de 5 à 6 micron= moins que la cellule donc plusieurs coupes par cellule possibles

déposer sur lame puis colorer et regardée au microscope

il faut fixer les cellules ,c’est a dire leur morphologie, par mort cellulaire avec du phormol. On regarde au temps t, on ne sait pas ce qui s’est passé avant ou après.

MET: micros. elect. a transmission

si on veut des tranches fines il faut quelque chose de très dur donc on met les cellules dans une substance qui va les rendre dures (paraffine prise chaude, cependant ce n’est pas très dur donc pas adapter pour coupes très fines, en microscopie optique)(on effectue une congelation pour coupe plus fine et pour encore plus fines on fait avec de la résine)

- Analyse des tissus et organes par histologie

colorants +++

Peu spécifiques et peu sensibles (ne permettent pas de voir ce qui se passe a l’intérieur de la cellule)

développement des méthodes de marquage qui utilisent fluorescence

Similaire a la lumiere blanche, mais lumière fluorescente

visualise un groupe de molecules qui passeraient inaperçu en lumière blanche, cependant on ne distingue pas très bien le contenu intracell

utilisée pour detceter des structures spécifiques dans les cellules et les tissus (colorants spécifiques de sites

le plus souvent couples a un anticorps qui reconnait une protéine spécifique

-utilisation d’un anticorps spécifique de la molecule d’intérêt couplé a un fluorochrome (bleu, rouge, vert)

-permet de detecter spécifiquement un type de protéines dans une cellule, et étudier sa localisation, de la quantifier. (image: cellules musculaire du coeur en rouge = > permet de voir l’organisation du cytosquelette )

on ne peut pas voir plus de 3 structure a la fois mais si on a une protéine située au meme endroit, leur superposition en couleurs nous permet de voir que les protéines sont au meme endroit.

Video microscopie entre 11) et 12)

- enregistrement par caméra et numérisation

- utilisée pour reconstruire des images en 3D

également pour suivre les mouvements intra-cellulaires (cellules vivantes)

permet de prendre en compte la variable de temps

12) -microscope classique, auquel on a ajoute: - un laser

- un système électronique et informatique

- des composants optiques

gagne en netteté +++ par rapport au microscope classique (RE relie au filament -> permet de voir l’intérieur de la cellule)

permet d’étudier la structure 3D

permet de faire des doubles ou triples marquages

- permet de voir des objets très petits

resolution microscopie photonique : 200 nm

resolution microscopie électronique :2nm

on ne descend pas plus ba car on ne s’intéresse pas a la structure physique

- preparation spéciale

donne des images avec details, ou des representations en 3D

(image: noyau et RE autour)

14) a permis de visualiser la protéine prion -> vache folle

microscopie électronique + reconstitution 3D

congélation très rapide en bain d’ethanol liquide car lui meme dans un bain d’azote liquide a -70°C -> éviter la fabrication de cristaux de glace qui peuvent faire

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