Compte-rendu sur la SFP

Le résumé :  

Introduction : 400 mots

La chymotrypsine, une enzyme protéolytique d'origine pancréatique agissant dans l'intestin grêle, assume un rôle prépondérant dans la dégradation des protéines alimentaires en acides aminés. En tant qu'endoprotéase, elle exerce son action en clivant sélectivement les liaisons peptidiques internes des protéines.

La chymotrypsine est inactive sous sa forme native, le chymotrypsinogène. Elle doit être activée par la trypsine, une autre protéase sécrétée par le pancréas. L'activation de la chymotrypsine se fait par clivage d'un peptide N-terminal, libérant la sérine catalytique de l'enzyme.

La chymotrypsine peut être présente sous sa forme native ou dénaturée. La forme native est stable et fonctionnelle, tandis que la forme dénaturée est instable et inactive. La dénaturation de la chymotrypsine peut être causée par des facteurs tels que la température, le pH, la force ionique ou la présence de solvants organiques.

Les agents stabilisants sont des substances qui peuvent aider à stabiliser les structures des enzymes de la dénaturation. Les agents stabilisants utilisé durant ce TP pour la chymotrypsine sont le sorbitol et le PEG (polyéthylène glycol). Ces agents stabilisent la chymotrypsine en formant des liaisons hydrogène avec ses résidus d'acides aminés.

L'urée est un agent dénaturant qui peut causer la dénaturation de la chymotrypsine. L'urée interagit avec les liaisons hydrogène de la chymotrypsine, ce qui perturbe sa structure native et la rend instable et inactive.

Durant ce TP, nous allons étudier l'effet des agents stabilisants (sorbitol et PEG) et de l'urée sur l'activité de la chymotrypsine.

Les méthodes :

Partie A :

• Mesure de la stabilité et dénaturation de la chymotrypsine

• Solution de chymotrypsine concentrée (pool)
• Solution HCl 10-2 M
• Sorbitol 8 M (MW sorbitol : 182,18 Da)
• PEG-SH 100mM dans HCl 10-2 M
• Solution concentrée d'urée à 8 M.
• H2O ultrapure MiliQ
• Spectrophotomètre à 412 nm
• Micropipettes
• Eppendorf
• Cuve (9)

Tests d'activité de la chymotrypsine en condition saturante en substrat :

Chymotrypsine : 

• Mélanger 100 μL de chymotrypsine avec 100 μL de HCl 10-2 M.

Chymotrypsine/sorbitol :

• Mélanger 100 μL de chymotrypsine avec 25 μL de sorbitol et 75 μL de HCl 10-2 M.

Chymotrypsine/PEG-SH :

• Mélanger 100 μL de chymotrypsine avec 100 μL de PEG-SH

Dosage de l'activité chymotrypsine

• Préparer 9 cuves pour effectuer les mesures de spectrophotométrie a 410nm, dans chacune Mélanger 2,7 mL de tampon d'activité (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) avec 300 μL de Bz-Y-pNA à 2 mM. 
• Prélever 3 fois 10 μl de chaque échantillon pour effectuer un dosage de l'activité chymotrypsine.

Partie B : Préparation des plaques 96 puits

Dans les lignes A et B (chymotrypsine), nous ajoutons 10 µL de protéines dans chaque puits, puis nous ajoutons 15 µL de solution tampon, on ajoute les volumes d’H2O et d’urée présent sur le tableau précédemment, le tout pour un volume total de 330 µL dans chaque puits.

Dans la ligne C, nous ajoutons 41,25 µL de sorbitol 8M pour obtenir une concentration finale de 1M. Nous compensons en soustrayant le volume correspondant d'eau. La même méthode est utilisée pour les puits 11 et 12, en ajoutant 263,75 µL d'urée 6,40M.

Dans la ligne D, nous répétons les mêmes conditions en utilisant l'échantillon 3 (chymotrypsine + Peg).

Dans la ligne E, nous ajoutons 10 µL d'eau dans chaque puits, ce qui donne un volume total de 330 µL.

Résultats :

Partie A :  [pic 1]

Lorsque la chymotrypsine est ajoutée seule au substrat Bz-Y-pNA, l'absorption augmente rapidement au cours des premières minutes, puis atteint un plateau.

Lorsque la chymotrypsine est ajoutée au substrat en présence de sorbitol, l'absorption augmente également rapidement au cours des premières minutes, mais le plateau atteint est plus élevé que dans l'expérience 1, Mais en présence de PEG, l'absorption augmente lentement au cours du temps mais elle atteint des valeurs plus élevées.

Evolution des vitesses initiales en fonction des jours :

[pic 2]

La chymotrypsine voit sa vitesse de réaction augmenter au fil des jours. La vitesse de réaction de la chymotrypsine associée au sorbitol ou au PEG est plus élevée que celle de la chymotrypsine seule. Cependant, contrairement au PEG, le sorbitol voit sa vitesse de réaction diminuer après le troisième jour.

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