Zymographie

Les métalloprotéases matricielles (MMPs) sont des protéases, enzymes protéolytiques sécrétées par les fibroblastes. Sous forme activée elles sont capables de dégrader la plus part des composants de la matrice extracellulaire et elles jouent un rôle fondamental au cours du remodelage de la matrice extrcellulaire.

Afin de déterminer l’activité et la sécrétion des gélatinases MMP-2 et MMP-9, des fibroblastes ont été cultivées et traitées avec deux drogues : la colchicine et la cycloheximide. La cycloheximide étant un inhibiteur qui bloque la synthèse protéique en phase d’initiation, c’est donc la synthèse des nouvelles protéines qui sera inhibée. Cela nous permettra de savoir si la quantité des MMPs activées dans le surnageant est affectée par cette inhibition (pendant 24heures). Le deuxième inhibiteur, la colchicine est une molécule qui se lie aux hétérodimères d’ α/β tubuline, qui sont utilisés pour la polymérisation des microtubules, cette molécule empêche cette polymérisation et a pour conséquence la non élongation des microtubules. Cela va nous permettra de savoir si cette conséquence affecte la sécrétion et l’activation des MMPs.

Pour répondre à ces questions une zymographie sur gel de gélatine puis une électrophorèse SDS-PAGE après traitement de fibroblastes en culture à la colchicine et au cycloheximide ont été réalisés.

L’expérience a pour but l’étude de l’activité des MMP-2 et MMP-9 et de voir si les drogues utilisées ont un effet sur les MMPs.

Zymographie : Cette technique est basée sur l'électrophorèse (SDS-PAGE), elle permet de détecter l'activité enzymatique. Le substrat est polymérisé dans la matrice du gel de polyacrylamide. Les échantillons soumis à la zymographie sont préparés avec le tampon SDS-PAGE. Après l'électrophorèse, le SDS est retiré du gel par incubation dans un bain de Triton, qui déplace le SDS fixé sur les protéines et permets la renaturation en structure secondaire et tertiaire. Ensuite, un tampon d'activation approprié est sélectionné et le zymogramme est incubé pendant une durée et à une température déterminée .Enfin, le zymogramme est coloré. Les zones de digestion sont distinguées comme des bandes pâles sous un fond sombre.

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