Activité 6 : comprendre le mécanisme de réplication

Ce qui est connu : On sait que l’ADN est copié (= répliqué) durant la phase S de l’interphase. On rappelle que la structure de l’ADN dans le chromosome est une molécule formée de deux brins (la structure est appelée pour cette raison, structure bicaténaire = deux chaînes). Chaque brin est formé d’un enchainement de nucléotides. Les nucléotides des deux brins d’ADN qui se font face sont associées de façon complémentaire, Adénine A en face de thymine  T, Cytosine C en face de guanine  G. L’ensemble a une structure en double hélice (montré par J. Watson et F. Crick en 1953).

Consigne 1 : schématiser une molécule d’ADN d’après le texte et vos connaissances de seconde

trois modèles possibles de réplication de l’ADN

Afin d’expliquer comment se fait la réplication de l’ADN avant la mitose, plusieurs hypothèses avaient été émises à l’époque.

1. Hypothèse conservative (hypothèse de Watson et Crick, 1953) : la molécule d’origine est conservée et la réplication créé une molécule « fille » entièrement nouvelle.

1. Hypothèse semi-conservative (hypothèse de M. Delbrück et G Stent, 1957) : les deux brins de la molécule d’origine sont dissociés et chaque brin sert de matrice pour la synthèse d’un brin complémentaire. Chaque nouvelle molécule « fille » est donc formée d’un brin issu de la molécule mère, et d’un brin nouveau

1. Hypothèse semi-conservative (hypothèse de M. Delbrück et G Stent, 1957) : les deux brins de la molécule d’origine sont dissociés et chaque brin sert de matrice pour la synthèse d’un brin complémentaire. Chaque nouvelle molécule « fille » est donc formée d’un brin issu de la molécule

Consigne 2 : Réaliser un schéma simple qui illustre pour chaque hypothèse, la façon dont est répliquée l’ADN

Document de référence : Méthode expérimentale pour éprouver les hypothèses

Afin de vérifier quelle hypothèse est correcte, Meselson et Stahl réalisent en 1957 une expérience célèbre.

Quelle que soit l’hypothèse, dans tous les cas l’ADN se forme par polymérisation ( assemblage) de nucléotides créés par la cellule. Un des composants chimique principaux des nucléotides est l‘azote N. La cellule a donc besoin d’azote pour créer de nouveaux nuclétoides et de l’ADN lors de la réplication ( ci-dessous structure chimique de la partie base azotée de chaque nucléotique)

[pic 1]

Meselson et Stahl ont eu l’idée de cultiver des bactéries ( EV unicellulaire)  soit sur un milieu contenant de l’azote « lourd », soit sur un milieu contenant de l’azote « léger » (l’azote lourd correspond à l’isotope 15N, non radioactif, mais contenant un neutron de plus que l’isotope 14N). Les deux isotopes sont utilisés de la même façon par les cellules, sans discrimination. Les molécules d’ADN ayant incorporé de l’azote lourd 15N durant la réplication seront plus denses que les molécules d’ADN ayant incorporé de l’azote léger 14N[pic 2]

Pour distinguer les molécules d’ADN lourdes des molécules d’ADN légères, Meselson et Stahl ont inventé un nouveau mode de centrifugation : la centrifugation sur gradient de densité de chlorure de césium. En effet, quand on soumet une solution aqueuse de chlorure de césium à une centrifugation à grande vitesse, le chlorure de césium se répartit selon un gradient de concentration, la partie la plus concentrée, et donc la plus dense étant située en bas du tube, et la partie la moins concentrée, donc la moins dense étant située près de la surface de la solution, donc en haut du tube. Entre ces deux extrémités, la densité change progressivement de façon linéaire. (Ce gradient disparait lorsque la centrifugation cesse, le chlorure de césium se répartissant de nouveau de façon homogène dans le tube par les forces de diffusion.)[pic 3]

La molécule d’ADN va se positionner dans le tube  selon sa densité. Plus elle est dense, plus est située en bas du tube

Document d’étude : Protocole précis l’expérience et résulrats de Meselson et Stahl

Meselson et Stahl cultivent des bactéries Escherichia coli pendant 17 générations dans un milieu dont la source d’azote contient uniquement 15N. Ils font pousser une autre culture dans un milieu dont la source d’azote contient uniquement 14N. L’ADN des deux cultures est extrait puis soumis à centrifugation sur gradient de densité. Ce seront les témoins (tube 1 et 2 ci-dessous)

Ils font ensuite pousser une autre culture d’E. coli dans un milieu contenant 15N puis la transfèrent dans un milieu contenant 14N, permettant ainsi aux bactéries de continuer à pousser. E. coli se reproduit en 20 minutes (ce qui correspond à un cycle cellulaire avec une réplication au cours de ce cycle). Meselson et Stahl prélèvent alors quelques bactéries correspondant à une génération sur 14N, deux générations sur 14N, trois générations sur 14N. Pour chaque échantillon, l’ADN est extrait et soumis à centrifugation (24heures à 100 000g, g étant l’accélération de la pesanteur). Ce sont les tubes 3,4 et 5 ci-dessous

(Remarque : dans leur expérience, les deux auteurs ont sélectionné des bactéries qui se divisent de façon synchrone =  au même moment)

Résultats de la centrifugation sur gradient de densité de chlorure de césium de l’ADN des bactéries cultivées dans les conditions précisées dans le protocole expérimental

[pic 4]

Consigne 3 : schématiser l’état de l’ADN dans les cultures témoin bactériennes 1et 2 puis dans les cultures 3,4,5 selon  chaque modèle de réplication

Vous devez utiliser les couleurs

- bleu pour un brin d’ADN lourd contenant de l’azote 15N

- rouge pour un brin d’ADN léger contenant de l’azote14N

Consigne 4 : Exploiter les résultats  de la culture 3 pour infirmer un des 3 modèles de réplication possible

Vous devez

1. Observer les résultats de la culture 3 et de chaque témoin : je vois ….
2. Apporter les notions de connaissances utiles : je sais ….
3. Déduire et répondre à la question, : je déduis ……..
4. Illustrer le contenu du tube si ce modèle était le bon

Consigne 5: Exploiter les résultats  de la culture 4 pour infirmer un des 2 modèles de réplication possible restant

Vous devez

1. Observer les résultats de la culture 3 et de chaque témoin : je vois ….
2. Apporter les notions de connaissances utiles : je sais ….
3. Déduire et répondre à la question : je déduis ……..
4. Illustrer le contenu du tube si ce modèle était le bon

Consigne 6 : Exploiter les résultats  de la culture 5 pour confirmer le modèle restant

Vous devez

1. Observer les résultats de la culture 3 et de chaque témoin : je vois ….
2. Apporter les notions de connaissances utiles : je sais ….
3. Déduire et répondre à la question : je déduis ……..