TP de nucléotide

BUT

 Vérifier la spécificité pour l’adénine de la dépurination par hydrolyse alcaline avec NaOH 1M.

 Détecter et doser les sites abasiques dans une solution de désoxyribonucléotide (dAMP ou 2’-

desoxyadenosine 5’-monophosphate)

 Mettre en évidence la possibilité d’appliquer le dosage à un oligonucléotide et le lien avec le

nombre d’adénines présentes dans la séquence.

 Contrôler la justesse et la répétabilité des prélèvements réalisés avec la micropipette P1000 mise

à votre disposition, par méthode gravimétrique.

2. PRINCIPE

 L’hydrolyse alcaline de désoxyribonucléotides (en solution ou dans une séquence d’ADN

simple brin) dans des conditions contrôlées (NaOH 1 M, 90°C, 10 min) permet une dépurination

spécifique des adénines présentes sur ces nucléotides, c’est à dire l’hydrolyse spécifique de la liaison

N-glycosidique (en rouge (fig. 1A)) reliant les adénines au désoxyribose. Cette réaction génère des sites

abasiques (nucléotides dépourvus de base) libérant le carbone anomérique du désoxyribose, qui devient

alors réducteur grâce au phénomène de mutarotation (fig. 1B). Ce pouvoir réducteur peut être détecté et

dosé grâce à la réduction d’ions Cu(II) en ions Cu(I), qui sont ensuite chélatés par l’acide bicinchoninique

(BCA) pour former un complexe chromophore (BCA)2-Cu de couleur pourpre, absorbant à 562 nm (fig. 1C).

On pourra donc corréler la valeur d’absorbance à 562 nm mesurée au nombre de sites abasiques, et donc

à la quantité d’adénines présentes dans une solution de mononucléotides ou d’oligonucléotides La méthode gravimétrique utilisée pour vérifier les qualités métrologiques de votre

micropipette P1000 est fondée sur la détermination, par pesée, du volume d'eau délivré par la pipette à

partir de la connaissance de la masse mesurée. Cette expérience a pour but de vérifier la justesse et

la répétabilité de l’instrument. Chaque binôme utilisera une seule pipette sur une seule balance pour

chacun des volumes nominaux, chaque membre du binôme effectuera 10 mesures. Les résultats

devront être traités mathématiquement et statistiquement, et intégrés à votre compte-rendu.

On appelle :

- volume nominal le volume indiqué sur l’instrument pour lequel une performance de justesse et de

reproductibilité a été spécifiée par le fabricant. Pour une P5000, ces volumes sont 500 et 5000 μL, pour une

P1000, ces volumes sont 200 et 1000 μL, pour une P200, ces volumes sont 20 et 200 μL, et pour une P20,

ces volumes sont 2 et 20 μL

- erreur systématique (justesse) la différence entre le volume distribué et le volume nominal ou volume

sélectionné

- erreur aléatoire (répétabilité) la dispersion des volumes autour de la moyenne des volumes distribués.

1. MODE OPERATOIRE

1.1. Mise en évidence de la spécificité pour l’adénine de la dépurination par hydrolyse alcaline de

désoxyribonucléotides monophosphates.

Afin de contrôler la spécificité pour l’adénine de la réaction d’hydrolyse, des réactions contrôles de

dépurination doivent être réalisées.

Préparer dans 4 microtubes Eppendorf numérotés les réactions détaillées le tableau de volumes suivant :

Tube n° 1 2 3 4 5

Vol.

désoxyribonucléotide

10 mM (μL)

TMP

110 dGMP 110dCMP

110

dAMP

110 L

Vol. H2O (μL) 400 290 290 290 290

Vol. NaOH 3 M (μL) 200 200 200 200 200

Les tubes doivent être vortexés après chaque ajout et avoir donc un volume final de 600 μL.

Incuber les tubes n°1 à 5 au bain marie à 90°C pendant 10 minutes.

Pendant l’incubation des tubes, préparer 8,16 mL de réactif BCA dans un tube Falcon de 15 mL en

mélangeant 8 mL de réactif A (réactif à base d’acide bicinchoninique) et 160 μL de réactif B (solution de

sulfate de cuivre(II), CuSO4).

BCH2001L Biochimie Expérimentale 1

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12

Après les 10 minutes d’incubation à 90°C, sortir les tubes du bain-marie puis ajouter dans chaque tube 400

μL de réactif BCA.

Incuber 5 minutes à température ambiante.

Régler le spectrophotomètre sur 562 nm, faire le 0 optique sur l’eau distillée en utilisant une des cuves de

spectrophotomètre d’1,5 mL fournies, puis transférer le contenu de chaque tube et noter l’absorbance à

562 nm, en commençant par le tube n°1 et en conservant la même cuve pour tous les tubes (et en rinçant

entre chaque échantillon).

1.2. Etablissement d’une gamme-étalon de dAMP et étude de la linéarité entre [dAMP] et A562nm.

Afin d’étudier la relation de linéarité existant entre la concentration de nucléotide (dAMP) initiale et

l’absorbance à 562 nm obtenue après dépurination par hydrolyse alcaline et traitement par le réactif BCA,

une gamme-étalon de dAMP doit être réalisée.

Compléter le tableau ci-dessous afin d’obtenir les 5 tubes de la gamme-étalon de dAMP, d’un volume

final de 600 μL et contenant les concentrations de dAMP indiquées dans la première ligne. Vortexer les tubes après chaque ajout.

Incuber les tubes de la gamme-étalon au bain marie à 90°C pendant 10 minutes.

Après les 10 minutes d’incubation à 90°C, sortir les tubes du bain-marie puis compléter chaque tube par

400 μL de réactif BCA (préparé lors de l’expérience 1.1.).

Incuber 5 minutes à température ambiante.

Transférer le contenu de chaque tube dans une des cuves de spectrophotomètre d’1,5 mL fournies et noter

l’absorbance à 562 nm, en commençant par le blanc et en conservant la même cuve pour tous les tubes.

Tracer la représentation graphique A562nm = f([dAMP])

1.3. Comparaison avec une gamme-étalon établie à l’aide d’un ose réducteur, le D-glucose :

Les valeurs d’A562nm obtenues pour la gamme-étalon de dAMP (expérience 3.2.) dépendent du nombre de

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