TP de SFP

Introduction

Les protéines fluorescentes ont permis des avancées phénoménales en biologie notamment la localisation et la détermination des fonctions de certaines protéines. L’une des ces protéines est la DsRed. La Discosoma Red Fluorescent protein (DsRed) est une protéine ayant la propriété d'émettre une fluorescence de couleur rouge. Retrouvée dans les coraux, elle a pu être clonée à partir du corail Discosoma sp. Les acides aminés responsables de sa fluorescence (une glutamine en position 66, une tyrosine en 67 et une glycine en 68 constituent le fluorophore appelé "cycle 3" se situent sur un gène qui peut être incorporé dans un génome. Cela permet d’étudier une protéine d’intérêt à l'aide d'un microscope à fluorescence (par exemple, savoir où se situe telle protéine dans tel organisme). Cette technique est très utilisée en biologie.

L'un de ses défauts est la lenteur de maturation de la protéine, c'est pour cela qu'il existe maintenant des variants de la DsRed qui ont été obtenus grâce à des mutations. Ces variants possèdent des propriétés plus adaptées à des applications médicales et scientifiques comme une augmentation de la brillance et une maturation plus rapide.

Partie I : Principe des techniques, protocole et calculs

Induction de la synthèse des protéines par l’IPTG

Principe :

L’opéron lactose est nécessaire au transport et au métabloisme du lactose chez plusieurs bactéries dont Escherichia Coli. F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff reçurent en 1965 le Prix Nobel de physiologie ou médecine pour avoir découvert en 1961 que l’opéron lactose est inductible et que le "système lactose" est régulé.

Lorsque la protéine répresseur se fixe sur l’opérateur, l’ARN polymérase ne peut plus initier la transcription ce qui empêche l’expression du gène. L’IPTG ('isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) est dit inducteur de la transcription car il se fixe sur le répresseur, ce qui rend ce-dernier inactif. Le gène est alors transcrit.

Protocole :

Mettre les bactéries contenant le plasmide DsRedT3 ou DsRedM à 37°C dans 2mL de milieu Lauria Broth (LB) avec de l’ampicilline à 50µg.mL-1 avec ou sans IPTG à 1mM.

Après 3h à 37°C, sédimenter les cellules induites (avec IPTG) ou contrôles (sans IPTG) par centrifugation à 10000 tours par minute pendant 5 minutes à 4°C.

Extraction des protéines DsRedT3 et DsRedM

Principe :

Pour étudier une protéine donnée, ici la DsRedT3 et DsRedM, il existe différentes techniques d’extraction et de caractérisations (structure, fonctions biologiques, caractéristiques physico-chimiques…) d’une protéine. La première étape est l’extraction de la protéine. Cette extraction peut se faire à partir du tissu entier, à partir d’un type cellulaire isolé du tissu, à partir d’un organite particulier… Dans ce dernier-cas, la centrifugation est utilisée, comme nous allons le faire.

Protocole :

Pour chaque protéine (DsRedT3 et DsRedM) :

• resuspendre le culot bactérien pour les cellules induites et pour les celles contrôles dans 1mL de tampon lyse (Tris-HCl à 50mM, à pH 8 et à 5% de lauryl-sarcosine),
• soumettre le mélange à trois impulsions de sonication de 10 secondes espacées de 30 secondes,
• incuber sous agitation pendant 15 minutes à température ambiante,
• réaliser trois impulsions de sonication de 10 secondes espacées de 30 secondes et
• centrifuger à 10000 rotations par minute pendant 5 minutes. Les surnageants sont récupérés et seront désignées EBT3+, EBT3-, EBM+ et EBM-.

Purification des protéines DsRedT3 et DsRedM

Principe :

Les chromatographies sont des techniques de séparation des protéines. L’étape de chromatographie est importante pour la purification des protéines. L’IMAC (immobilized metal affinity chromatography) est un type de chromatographie d’affinité qui repose sur l’immobilisation d’un atome métallique (nickel, cobalt,…) sur une résine. L’intérêt de cette technique est que cet atome de métal immobilisé peut établir des liaisons de coordination avec les chaînes histidine par exemple, grâce au noyau imidazole cet acide aminé.

C’est pourquoi, ici, une séquence Tag-Histidine a été intégrée dans la séquence des protéines recombinantes TsRedT3 et DsRedM.

L’ion Ni2+, utilisé ici, peut établir six liaisons de coordination dont trois ou quatre servent à son immobilisation sur une résine. Il en reste donc deux ou trois qui peuvent interagir avec les atomes d’azote de deux histidines.

Il faut faire passer la solution contenant la protéine à purifier dans la colonne de chromatographie contenant la résine et les ions Ni2+ immobilisés. Les molécules retenues ont probablement une histidine ou une partie affine pour les ions Ni2+. Les autres molécules ne sont pas retenues et peuvent être recueillies.

Il faut ensuite réaliser un gradient d’élution, un gradient de pH ou de concentration (dans ce cas, il s’agir de faire entrer en compétition une molécule qui présente une plus grande affinité pour les ions Ni2+). Ici, on choisira un gradient de pH décroissant. Lorsque le pH devient inférieur à 6, les histidines se protonnent et ne peuvent plus lier l’ion Ni2+. Elles sont éluées et peuvent être également recueillies.

La présence de la DsRed (T3 ou M) se vérifie à chaque étape par suivi de la coloration aux UV.

Protocole :

• Laver les billes de Nickel-Agarose contenues dans la colonne par deux ajouts successifs de 1mL de tampon Tris-HCl à 50 mM et à pH 8.
• Prélever et conserver la fraction charge (50µL de chaque extrait bactérie, EBT3+ et EBM+) puis déposer l’extrait bactérien induit EBT3+ et EBM+. Conserver ce qui n’est pas retenu (ce sera la fraction NR)
• Laver 3 fois les billes avec 0,5 mL de Tris-HCl à 50 mM et à pH 8, récupérer et conserver les lavages dans des tubes séparés (qui seront désignées comme les fractions L1, L2 et L3).
• Eluer par trois fois avec 200 µL de tampon Tris-HCl à 50 mM et à pH 8, Imidazole à 250 mM et conserver les fractions (fractions notéess E1, E2, E3) dans la glace.

Electrophorèse en conditions dénaturantes

Principe :

Cette technique permet la séparation et l’analyse des protéines en fonction de leur taille et de leur charge globale grâce à un champ électrique. L’électrophorèse peut aussi nous faire connaître l’état purifié ou non de la protéine.

On peut réaliser une électrophorèse particulière, en conditions dénaturantes pour rendre toutes les protéines négatives et ne les séparer qu’en fonction de leur poids moléculaire (les plus lourdes en haut et les plus légères, qui ont pu migrer, en bas) grâce à l’utilisation du SDS (SDS-PAGE : électrophorèse en gel de polyacrilamide contenant du dodécysulfate de sodium), ce que nous allons faire ici.

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