TP : électrophorèse de protéines, électrotransfert et immunorévélation

Compte rendu du TP : électrophorèse de protéines, électrotransfert et immunorévélation

But :

L’objectif principal de ce TP est l’analyse par électrophorèse des protéines récupérées dans différentes fractions lors du TP consistant à extraire une molécule d’intérêt, le lysozyme, du reste des protéines d’un blanc d’œuf.

Principes :

- Electrophorèse : il s’agit d’une méthode qui permet de séparer et de caractériser des molécules. Elle se base sur le déplacement de molécules chargées sous l’effet d’un champ électrique. Du fait de leurs caractéristiques propres et en fonction des conditions de l'électrophorèse ces molécules auront des vitesses de migration différentes, elles vont donc se séparer les unes des autres. A charges identiques, les molécules se sépareront selon leur taille. Nous utiliserons une électrophorèse dite sur gel, ce gel agit en réalité comme un tamis moléculaire à travers duquel les petites molécules circuleront plus facilement que les grosses et donc migreront plus loin à travers le gel. Nous avons utilisé un gel de polyacrylamide a différentes concentrations, ces différentes concentrations forment des maillages plus ou moins serrés donc facilitant plus ou moins la migration des différentes molécules. Notre électrophorèse a également été réalisée en conditions dénaturantes en présence de SDS (détergent) qui charge négativement l’ensemble des molécules des fractions. Ainsi, notre électrophorèse sépare bien nos molécules en fonctions de leurs poids moléculaires, les plus petites migrant plus loin.

- Gel de séparation et gel de concentration : le gel de séparation constitué d’acrylamide, de bisacrylamide (agent pontant), de TEMED et d’ammonium persulfate (agents permettant la polymérisation) est le premier gel coulé et est le gel de l’électrophorèse a proprement parlé puisqu’il est le siège de la séparation des molécules. Le gel de concentration est lui coulé au dessus du gel de séparation et a pour but de permettre une entrée homogène de l’échantillon dans le gel de séparation et de le concentrer pour donner une bande fine.

- Transfert : l’immunorévélation que nous effectuons nécessite un transfert des protéines du gel d’électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose. Ce transfert s’effectue selon un montage appelé sandwich dans lequel la nitrocellulose et le gel sont mis en contact entre 2 éponges imbibées de tampon et du papier Watmann. Cet ensemble est alors placé dans la cuve sous un courant électrique de 50V permettant ce transfert.

- Immunorévélation : après avoir effectué le transfert, nous effectuons une immunorévélation. Cela consiste en l’utilisation d’anticorps dirigés contre la protéine d’intérêt qui vont donc se fixer à celles-ci. Ce sont ces anticorps que nous pourrons détecter. Cependant, les anticorps ne vont pas se fixer uniquement sur les protéines et vont avoir tendance a se fixer sur le support rendant illisibles l’immunorévélation. C’est pourquoi on utilise du lait pour saturer tous les espaces vides ou les anticorps seraient susceptibles de se fixer.

-Glycérol: Le glycérol mélangé à l'échantillon permet d'alourdir celui-ci en vue de procéder à une électrophorèse. En effet, lors du dépôt des échantillons dans les puits de la membrane ceux-ci pourront se déposer directement au fond du puits sans se diffuser dans le milieu (tampon de charge).

Résultats

Analyse du pouvoir résolutif:

Ehgliuehg

Acrylamide à 15% Acrylamide à 10%

Log PM (en Da) Rf (en cm) Rf (en cm)

Phosphorylase B 5,575187845 0.4 1.7

Sérum Albumine 4,826074803 0.7 2.5

Ovalbumine 4,633468456 1.2 3.6

Anhydrase Carbonique 4,477121255 2 5.1

Inhibiteur Trypsine 4,303196057 3

α-lactalbumine 4,158362492 3.9

La première chose que l'on peut constater c'est qu'en utilisant le gel à une concentration de 10% de polyacrylamide, deux molécules du marqueur sont sorties du gel, là où pour le gel à 15% elles étaient restées. Il s'agit de l'inhibiteur de Trypsine (20100 Da) et de l' α-lactalbumine (14400 Da). Le gel à 10% n'est donc pas adapté si l'on désire se placer dans une fourchette de poids moléculaire allant de 376 kDa à 14.4 kDa. Nous avons, grâce au graphique tracé au dessus, pu déterminer le pouvoir résolutif de chacun des gels. Le pouvoir résolutif est une fourchette de poids moléculaire où le pouvoir de séparation des molécules par électrophorèse est optimum. Pour cela, il suffit de tracer log PM=f(Rf), puis en utilisant les tangentes de chacune des courbes, on retrouve un intervalle de poids moléculaire, c'est le pourvoir résolutif.

Pour le gel à 15%: - Valeur haute: 4.72 - Valeur basse:

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