Protocole de calcul du degré d'hydrolyse

Hydrolysats protéiques :

Détermination du degré d’hydrolyse par la méthode OPA

1.0  Introduction

Cette méthode spectrophotométrique, utilisant l’OPA (o-Phthaldialdéhyde), permet de quantifier le degré d’hydrolyse du lait et des protéines laitières (Church et al., 1983) en déterminant précisément le nombre de liens peptidiques.

1.1 Principe

La méthode est basée sur la réaction de l’o-Phthaldialdéhyde et du β-Mercaptoéthanol avec les groupements α-aminés relâchés lors de l’hydrolyse. Ces composés forment alors un complexe qui absorbe fortement à une longueur d’onde de 340 nm. Les résultats sont exprimés en % du degré d’hydrolyse. Comme la protéine intacte comporte des groupements α-aminés, le substrat de départ devra être analysé afin d’en soustraire la valeur à celle des échantillons hydrolysés. Lors de l’analyse d’un hydrolysat présentant un degré d’hydrolyse élevé, il est nécessaire de diluer l’échantillon afin de respecter la loi de Beer-Lambert (D.O. situées entre 0,1 et 0,7). En effet, plus le degré d’hydrolyse sera élevé, plus il y aura de groupements α-aminés libérés.

1.2 Domaine d’application

Cette méthode est sensible, simple et directement applicable à toutes les protéines laitières.

2.0 Matériel et réactifs utilisés

2.1 Matériel

2.2 Réactifs

Tétraborate de sodium; décahydrate, ACS; Na2B4O7∙10 H2O

Sodium dodécyle sulfate (SDS) ou sodium lauryl sulfate; >98% Purifié

o-Phthaldialdéhyde; 1,2-Phthalic dicarboxaldehyde; conserver à 4°C

β-Mercaptoéthanol; 2-Mercaptoéthanol, HSCH2CH2OH; conserver sous une hotte ventilée

Méthanol

D-L-Leucine; 99+%

3.0 Mode opératoire

3.1 Préparation des solutions

Les solutions de SDS peuvent être préparées à l’avance et conservées au réfrigérateur pendant un mois (forme un précipité blanc lorsque refroidi. Il faut chauffer légèrement et agiter environ 30 minutes pour tout resolubiliser) lorsque utilisées pour des analyses ultérieures. La solution de D-L-Leucine ainsi que le réactif d’OPA doivent être préparés le jour même de l’analyse.

Prévoir suffisamment de chacune des solutions pour effectuer 1 blanc, 3 courbes standards et l’analyse des échantillons en triplicata, ainsi que des reprises.

[pic 1]

Les quantités inscrites dans les lignes qui suivent permettent de faire 31 cuvettes, soit 1 blanc, 12 standards, et plus de 6 échantillons, sans (avec) répétitions.

1.         Sodium dodécyle sulfate 1% et 20% (p/p)

1%: 10 g SDS / 495 mL d’eau distillée

        20%: 20 g SDS / 80 mL d’eau distillée

Bien laisser hydrater (30 minutes) puis chauffer légèrement la solution en poursuivant l’agitation; se solubilise entièrement lorsque tout le volume d’eau est ajouté. Attention de ne pas agiter trop fortement, le SDS produit une mousse très stable.

2.         Solution mère de D-L-leucine 3 mM  (75 mL pour 3 séries)

1 M = 131,17 g / 1000 mL

3 mM = 0,394 g / 1000 mL = 0,0394 g / 100 mL SDS 1%

3.        Courbe standard D-L-leucine à partir de la solution mère

Préparer 3 séries pour répétitions (3 béchers pour chaque dilution)

0,75 mM        2,5 mL soln mère        +        7,5 mL SDS 1%

1,5 mM                5 mL soln mère                +        5 mL SDS 1%

2,25 mM        7,5 mL soln mère        +        2,5 mL SDS 1%

3,0 mM                10 mL soln mère

4.        Tétraborate de sodium 100 mM

1 mole = 381,37 g

38,137 g / 1000 mL d’eau distillée

3,8138 g / 100 mL

Difficile à solubiliser. Un chauffage léger facilite la solubilisation.

[pic 2]

Préparer la solution et le réactif d’OPA juste avant d’effectuer l’analyse au spectrophotomètre

6.        Solution OPA

0,160 g OPA / 4 mL méthanol: pour 200 mL de réactif d’OPA

7.        Réactif d’OPA

Dans une fiole de 200 mL, mélanger 100 mL de tétraborate de sodium, 10 mL de SDS 20%, la solution d’OPA (160 mg OPA / 4 mL méthanol) et 400 μL de β-mercaptoéthanol. Compléter jusqu’au trait de jauge avec de l’eau distillée.

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