Bases Cellulaires de la pharmacologie et toxicologie

TRAVAUX PRATIQUE 2013

BASE CELLULAIRES DE LA PHARMACOLOGIE ET TOXICOLOGIE

PLAN

I. Introduction

II. Matériels et méthodes

III. Résultats et discutions

IV. conclusion

Introduction :

Lors de notre séance de travaux pratiques nous allons mettre en culture des cellules dans un but de faire des tests sur ces dernières. Nous allons tester sur des cellules stressés ou non un nombre de molécules à des doses différentes, afin d’avoir les meilleures conditions, mais cette manipulation doit se faire dans des conditions de stérilité très stricte parce que les cellules sont très sensibles, nous allons prendre une lignée de neuroblastomes humains , nous allons dans un premier temps faire de la culture cellulaire et pour avoir une certitude sur la bonne croissance de ces cellules après nous allons faire des tests pharmacologiques sur ces cellules.

Matériels et méthodes :

Matériels utilisés :

-plaques 4, 12,24 puits

-boite de pétri

-pipette pasteur

-cellule de malassez

-microscope

-hotte à flux laminaire

-centrifugeuse

-bain marie

-incubateur

Méthodes :

Nous allons utilisés des cellules de souche SH-SY5Y qui viennent d’une tumeur solide extra-crânienne et un milieu complet composé de (DMEM) à 4,5 g/L de glucose, plus 10% de sérum de veau fœtal (svf) et 1% d’un mélange penicilline_sterptomycine (ps)

1)trypsination :

Tout d’abord nous allons faire la trypsination qui permet de décoller les cellules de la paroi du flacon car la trypsine clive après les acides amines basiques comme la lysine et l’arginine, puis compter les cellules à l’hémocytométre de malassez

2) congélation :

Nous allons prendre un volume correspondant a un nombre allons de 1 million à 2 millions de cellules suivant le nombre de cellules trouvées, après trypsination nous allons mettre du DMEM/10SVF pour une partie du groupe et SVF seul pour l’autre partie du groupe sachant que le SVF est un inhibiteur de l’action de la trypsine et nous allons mettre le suspension cellulaire dans une ampoule à congélation contenant du DMSO qui fige les cellules et empêche la formation des cristaux d’eau a cette température donc les cellules sont protéger de l’éclatement

3) Prétraitement des cellules SH-SY5Y :

Nous allons mettre les cellules SH-SY5Y dans une plaque 24 puits, la première colonne de la plaque sera la colonne des témoins c'est-à-dire qu’il n’aura pas d’ajout d’agent pharmacologique, pour les cinq autres colonnes nous allons ajouter des concentrations croissante d’un agent pharmacologique pour notre part c’est l’acétaminophène avec des concentrations (0,1_10_100_500_1000 µM) d’autre binôme ferons pour d’autre agent pharmacologique comme l’alpha-tocophérol et l’agent X qui est inconnu

Nous allons par la suite ajoutés un agent de stress oxydative qui est le peroxyde d’hydrogène(H2O2) ,pour les dernières ligne de la plaque à des concentrations croissante (0,5mM_0,25mM_0,125Mm_0,0625mM)

4) Stress de cellules et courbe de croissance :

Nous allons mettre un agent de stress dans notre plaque 4 puits, l’agent sera le peroxyde d’hydrogène avec une concentration de 0,5mM, puis nous allons mettre la plaque dans l’incubateur.

Pour le dénombrement de cellules pour effectuer une courbe de croissance, nous allons aspirer le milieu des puits puis ajouter un tampon de phosphate avec du sel qui est le PBS après nous allons ajouter la trypsine-EDTA pour le décollement des cellules et nous allons ajouter du milieu complet, pour un comptage avec les cellules à l’hémocytométre .

5) Mesure de la survie cellulaire (Test au MTT) :

Nous allons prendre nos cellules qu’on mettra a incuber à 37°c avec du MTT(10µL par puits,5mg) pendant 2 heures dans du milieu de culture, les cristaux de formazan sont solubilisés par ajout de DMSO dans chaque puit,nous allons utilisés une plaque 96 puits pour mesurer l’absorbance dans chaque puits a 550nm.

6) Mesure de l’apoptose (activité caspase 3) :

Nous allons prendre nos cellules et les rincées par un volume de PBS et après elles sont rincées avec un tampon de lyse froid à 4°c de composition (10mM tris,désoxychlolate 1% trionx _100 ,PH 7,5)

Apres elles sont incubées à 4°c pendant 10 minutes pour la mesure de l’apoptose nous devons mesurer l’activité de la caspase 3et pour cela nous devons mesurer le produit de la réaction entre la caspase 3 et son substrat par photométrie ,pour cela nous allons mettre 80µL de chaque échantillon et 110µL de tampon de réaction ,l’importance de l’absorbance est proportionnelle au clivage du substrat par la caspase.

Résultats et discutions :

1)trypsination :

Purs pour faire l’ensemencement dans une plaque , 4 puits (2cm²/puit) pour avoir 20000 cellules dans 2 puits et 40000 cellules dans les deux autres puits, pour cela, il faut calculer le volume à prélever pour avoir ce nombre de cellules, sachant qu’on compte un nombre donnée de cellules dans 1ML on pourra calculer le volume

...