Titrage d’un sérum de lapin par ELISA

Titrage d’un sérum de lapin par ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

I) But de la manipulation

L’intérêt général de la manipulation est de détecter et « doser » l’anticorps spécifique anti-BSA dans le sérum d’un lapin immunisé par la BSA grâce à la technique ELISA.

Au préalable, on a immunisé un lapin avec de la BSA (Albumine Sérique Bovine) qui est une protéine de bovin donc en théorie du non soi de lapin. On s’attend à une réponse immunitaire adaptative avec une réponse humorale donc avec la présence d’anticorps spécifiques anti-BSA circulant dans le sang. Le lapin est immunisé en sous cutanée. L’albumine en temps normal n’est pas dangereuse mais la présence d’adjuvants créer un contexte de déséquilibre. C’est pour cela que les cellules dendritiques interviennent, elles ingèrent le BSA et expriment à leurs surfaces les peptides dégradés de la BSA et migrent vers les ganglions. Dans le ganglion, l’antigène est reconnu par les lymphocytes T et B. Les lymphocytes T au contact de l’antigène présenté par la cellule présentatrice prolifèrent et se différencient en effecteurs. Les lymphocytes B au contact de l’antigène, prolifèrent et se différencient en plasmocytes. Les anticorps solubles sont la forme sécrétée du BCR (récepteur du lymphocyte B).

Le but général du TP est de savoir si l’injection du BSA avec des adjuvants entraine une réponse immunitaire adaptative avec la sécrétion d’anticorps soluble que l’on va essayer de déterminer avec un test ELISA.

II) Principe de l’ELISA

L’ELISA est une méthode expérimentale qui fonctionne grâce à la spécificité d’interaction entre l’antigène et l’anticorps. Ce test permet à la fois de doser un anticorps ou bien de détecter la présence d’un antigène.

Dans le TP, ce test consiste à doser un anticorps de lapin anti BSA à l’aide d’un support tapissé de BSA et d’un anticorps secondaire anti anticorps de lapin couplé à une enzyme. Lors de la première étape, on fixe le BSA au fond de nos puits. Il faut ensuite laver la plaque pour éliminer l’excès d’antigène non absorbé à l’aide de la solution tampon PBS-Tween. On incube dans les puits le sérum de lapin, les anticorps anti-BSA vont se fixer spécifiquement sur l’antigène. Les puits sont ensuite lavés pour enlever les anticorps non fixés (car le sérum de lapin ne contient pas uniquement les anticorps anti-BSA mais tous ces anticorps). Après cela, on dépose dans nos puits l’anticorps anti-anticorps de lapin (produit en immunisant une autre espèce par exemple une chèvre avec un antigène de lapin) couplé à une enzyme par liaisons covalentes sur sa chaine lourde. On utilise des anticorps secondaires pour amplifier le signal, en effet les anticorps primaires sont des anticorps polyclonaux qui reconnaissent l’épitope spécifique de l’antigène de BSA (schématiquement un anticorps pour un antigène). Mais les anticorps secondaires sont aussi polyclonaux et reconnaissent tous les épitopes des anticorps de lapin (schématiquement plusieurs anticorps secondaire pour un anticorps primaire). Il faut laver pour enlever l’excès d’anticorps. La dernière consiste à remplir nos puits avec un substrat (pNPP) qui va être hydrolysé par l’enzyme et sa dégradation entrainera un produit coloré (jaune) que l’on pourra doser à l’aide d’un spectrophotomètre. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration d’anticorps à doser.

III) Méthodes d’expérimentations

A. Les procédés et les réactifs / les contrôles

Durant ce TP, on a utilisé :

- PBS Tween 0,05% un tampon phosphate salin. Dans la colonne 1 (A  D) le tampon est utilisé comme blanc de manipulation, il n’y a pas de sérum c’est le bruit de fond de l’expérience. Ensuite, des dilutions des sérums ont été faites à l’aide de ce tampon. On utilise un détergent doux pour éviter les agrégats. - BSA 10% est l’antigène concentré à 10g/100mL. - Sérum de lapin normal est le sérum du même lapin avant immunisation au BSA. C’est la situation contrôle de l’ELISA pour la détection d’anticorps anti-BSA. - Sérum de lapin anti-BSA est le sérum du même lapin mais immunisé au BSA. C’est celui dont on veut détecter la présence d’anticorps anti-BSA. - Solutions acide et basique sont des contrôles utilisés pour savoir si le pH influence l’interaction Ag-Ac. - NP 40 et SDS sont des contrôles utilisés pour savoir si le détergent influence l’interaction Ag-Ac. - Sonde anticorps secondaire : immunoglobuline de chèvre anti-anticorps de lapin couplé à une enzyme phosphatase alcaline, qui permet d’amplifier le signal de l’interaction Ag-Ac en reconnaissant les anticorps de lapin. - para-Nitro Phényl Phosphate (pNPP) dégradé par l’enzyme donne une couleur jaune quantifiable par spectrophotométrie.

On a effectué des dilutions pour savoir si les résultats de l’expérience d’ELISA est spécifique de l’interaction anticorps anti-BSA de lapin et antigène BSA. Si la concentration de sérum diminue sous l’action des dilutions, la densité optique devrait diminuer proportionnellement.

B. Les fractions de purification

Les fractions sont issues de la purification du sérum anti-BSA par chromatographie d’affinité vis-à-vis de l’antigène sur une colonne d’immunoabsorbant. Le but est d’isoler uniquement les anticorps antiBSA. Pour cela on fixe du BSA sur la colonne, en versant le sérum immun anti-BSA (1mL) seul les anticorps anti-BSA se fixeront sur la colonne. Grâce à la variation de pH (pH acide 3,5) on a pu éluer notre colonne (Le pH acide dénature les anticorps qui se décrochent de l’antigène et sortent de la colonne. Il suffit d’une solution basique pour rétablir un équilibre) 4 fois avec 1 mL de solution acide pour avoir 4 fractions d’élutions.

Grâce à ELISA, on va pouvoir déterminer lorsque nos anticorps

...