TP: phosphatase alcaline.

TP phosphatase alcaline

I-But

Ce TP nous permet d’étudier la cinétique de la phosphatase alcaline. Pour cela, nous allons dans un premier temps définir les différents paramètres cinétiques de cette enzyme :

        -constante de Michaelis Km

        -La vitesse maximale Vmax

        - la constante catalytique k cat

        - l’activité spécifique AS

Dans un second temps nous étudierons le mécanisme de cette dernière en présence d’un ou de deux substrats que sont le glycérol-phosphate et le p-nitrophényl phosphate (pNPP), un composé incolore qui par hydrolyse va libérer du p-nitrophénol (pNP) jaune dans un milieu alcalin.

II-Principe

Rôle de l’enzyme

Une enzyme est une protéine qui possède des propriétés catalytiques. Elle agit en abaissant l’énergie d’activation d’une réaction chimique, ce qui accroît la vitesse de réaction. Au cours de la réaction, la structure de l’enzyme n’est pas modifiée, mais les molécules initiales que sont le substrat vont former des produits en fin de réaction. L’équilibre chimique entre le substrat et le produit n’est pas modifiée.

La phosphatase alcaline est une enzyme présente dans différents tissus organiques, plus particulièrement au niveau du foie, la muqueuse intestinale, les reins et autres organes. Dans le cadre de ce TP, nous utiliserons une préparation commerciale de phosphatase alcaline issue de la muqueuse intestinale de veau. Cette phosphatase va hydrolyser la liaison phosphoester avec la formation d’un groupement hydroxyle tel qu’un alcool, ou d’un phénol. Ainsi que la formation d’un phosphate inorganique. Pour doser la quantité de produits apparus dans le milieu, l’ajout d’un substrat sera nécessaire. Nous utiliserons alors le pNPP qui libérera par hydrolyse du pNP, coloré en jaune. Tous les dosages lors de ce TP se feront à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde λ= 410 nm pour permettre la quantification de produit

Voici la réaction colorée obtenue avec la phosphatase alcaline

[pic 1]

Nous allons utiliser une technique d’analyse quantitative pour la formation de pNP qui va absorber à une longueur d’onde spécifique de 410 nm. Le fonctionnement d’un spectrophotomètre reste très simple, car la machine émet une source de lumière qui est rendue monochromatique à l’aide d’un système diffractant (à l’aide de la mise en place d’une grille), ce système est privilégié car l’utilisation d’un système dispersant comprenant un prisme était plus coûteux et plus sujet à d’éventuels mouvement, donne des valeurs d’absorbance décalées. Alors qu’avec une grille, le système sera immobile car il sera fixé. Or pour obtenir la valeur d’absorption. Le spectrophotomètre calcule dans un [pic 2]premier la valeur de transmittance qui se base sur la formule suivante :

  I correspond à l’intensité transmise

[pic 3]  I o correspond à l’intensité incidente

Puis l’appareil donne la valeur de l’absorbance selon la formule suivante :

Pour déterminer la concentration de produit formé dans le milieu, la Loi de Beer-Lambert nous explique que l’absorbance est proportionnelle à la concentration d’une solution. Une mesure de l’absorbance nous permet de suivre alors la cinétique de la réaction chimique qu’est la formation de pNP.

Ainsi la loi de Beer-Lambert s’exprime selon les différents paramètres tels que « ε, l et c » pour former la formule suivante : Abs= [pic 4]

Nous allons vous définir les différents paramètres.

c correspond à la concentration molaire du pNP libéré exprimée en mol/ L

l correspond au trajet optique du faisceau lumineux parcouru entre les bords de la cuve, qui est égale à une valeur de 1 cm

ε correspond coefficient d’extinction molaire, cette valeur dépend de la longueur d’onde du faisceau et de le température dans la cuve qui est ici à 37°C

Ainsi le coefficient d’extinction molaire trouvé dans la gamme d’étalon va nous permettre après avoir lu les différentes valeurs d’absorbance, de déterminer la concentration de pNP. Une fois la concentration déterminée, on peut alors déterminer la vitesse initiale. En voyant alors que l’enzyme suit un modèle cinétique michaelien, il sera donc nécessaire de définir certains paramètres cinétiques pour comprendre le fonctionnement de la phosphatase alcaline.

Les différents paramètres à chercher seront la vitesse maximale de l’enzyme (écrit Vm) correspond à la valeur maximale atteinte par le système enzymatique lorsque la totalité de la quantité de l’enzyme sera complexé au substrat. Il sera exprimé dans la même unité que la vitesse initiale.

Le Km est appelé constante de Michaelis correspond à la dissociation du complexe ES s’exprime dans la même unité que la concentration en substrat soit en micromole/ L

Le kcat est la constante catalytique aussi appelé activité moléculaire qui s’exprime en nombre de molécules de substrat transformées par molécule d’enzyme et par unité de temps. On détermine cette constante en condition saturante de substrat.

Inhibition compétitive

Dans la seconde partie, l’ajout de Glycérol-phosphate en plus de pNPP met en place un mécanisme de compétition entre 2 substrats. Le Glycérol-phosphate agit comme un inhibiteur dans la formation de pNP. Pour déterminer ce type d’inhibition, on peut observer que le Glycérol-phosphate empêche au substrat qui est le pNPP d’occuper le site actif de l’enzyme. On peut ainsi définir la capacité de l’inhibiteur à se lier à l’enzyme en définissant la valeur de la constante de dissociation Ki du complexe EI. On note alors un déplacement de l’équilibre vers la forme du complexe EI lorsque les concentrations de l’inhibiteur sont plus fortes. Ce qui par ailleurs aboutit à une valeur plus élevée de la constante de dissociation du complexe ES.

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