TP lactate déshydrogénase

TP n° 1 : La Lactate Déshydrogénase

La lactate déshydrogénase est une enzyme catalysant la réaction suivante :

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L-Lactate    +    NAD+                                        Pyruvate     + NADH + H+[pic 4][pic 5]

Cette enzyme utilise comme cofacteur le NADH ; H+ (Nicotinamide Adénine  Dinucléotide) converti en NAD+, lorsqu’elle catalyse la conversion du pyruvate en L-lactate. Cette réaction correspond à la fermentation lactique qui se déroule dans l’organisme en condition d’anaérobiose. Elle permet de régénérer le NAD+ à l'issue de la glycolyse.

1. But

Ce TP consiste à purifier une enzyme, à savoir la lactate déshydrogénase (= LDH) contenu dans un extrait de tissu bovin fœtal.

1. Principe

1. La Chromatographie d’affinité

La purification de notre enzyme à partir de l’extrait de tissu fœtal bovin, a été réalisée par chromatographie d’affinité, qui comme toutes les chromatographies, permet de séparer les composants d’un mélange. Cette technique repose sur l’attirance que possède une molécule envers un ligand. Elle permet ainsi de purifier un composant en une seule étape. Ce type de chromatographie était par conséquent tout indiqué pour purifier une enzyme, qui par définition se fixe à un substrat précis.

[pic 6]La chromatographie d’affinité consiste à placer dans une colonne, une matrice insoluble (phase stationnaire) à laquelle est attaché un ligand spécifique de la molécule à purifier. Le mélange est alors versé sur la matrice et le composé à purifier se lie de manière réversible au ligand utilisée. La molécule d'intérêt se fixe donc à la matrice et les autres composants sont ensuite éliminés de la colonne par un  rinçage. Pour finir, on effectue l’élution (phase mobile) en détachant de la matrice la molécule qui descend alors vers le bas de la colonne et est récupérée purifiée.  

[pic 7]Pour pouvoir séparer des composants par cette méthode, il faut donc connaître la structure et la spécificité de la molécule d'intérêt afin de choisir un bon ligand, c'est-à-dire que le ligand ne doit pas accrocher d'autres composés que la molécule.

Comme cité précédemment, la lactate déshydrogénase utilise le NADH comme cofacteur, ce qui veut dire que le NADH est un ligand de l’enzyme.  Grâce à cette affinité, nous avons pu extraire l’enzyme en utilisant une molécule appelée bleu de Cibacron qui présente une analogie avec le cofacteur NAD+. Cette molécule analogue a été fixée par liaison covalente sur des billes de gel d’agarose (phase stationnaire).

La chromatographie s’effectue en quatre étapes qui sont l’équilibration, la fixation, le rinçage et l’élution.

L’étape d’équilibration de la chromatographie, a consisté à placer notre gel de bleu de Cibacron dans une mini-colonne et à l’équilibrer avec une solution tampon de lavage de PiNa (pH 7). Cette solution a ainsi permis d’éliminer l’éthanol (utilisé comme germicide) contenu dans le gel d’agarose. Cette étape est indispensable car l’éthanol dénature les protéines et donc notre enzyme à purifier. Le lavage a aussi permis d’instaurer un pH neutre, une des conditions chimiques favorables à la fixation de l’enzyme sur le gel de bleu de Cibacron.

Durant l’étape de fixation, l’extrait de tissu fœtal bovin a été versé dans la mini-colonne et la lactate déshydrogénase qu’il contenait s’est liée au gel de bleu de Cibacron. La fraction non retenue par le gel s’est écoulée dans la mini-colonne et a été récupérée. Il s’en est suivi l’étape de rinçage avec la solution tampon de lavage, qui a permis d’éluée complètement les résidus non liés au gel. Cette fraction de rinçage a également été conservée.

[pic 8]Pour finir, nous avons effectué l’étape d’élution de notre enzyme à l’aide d’une solution tampon contenant du NADH et de l’acide oxamique. Etant un inhibiteur compétitif analogue du pyruvate, l’acide oxamique s’est lié à l’enzyme, tout comme le NADH. Les interactions de ces deux ligands avec l’enzyme étant plus fortes que l’interaction effectuée avec le bleu de Cibacron, ont permis à la lactate déshydrogénase de se détacher de la phase stationnaire. Trois élution ont été effectuées  avec 1 mL de tampon d’élution et chacune d’entre elles a été récoltée dans trois tubes différents appelés respectivement E1, E2 et E3.

1. Le Spectrophotomètre

1. Mesure de l’activité enzymatique

Afin d’être sure que notre enzyme a bien été purifiée et qu’elle se trouve dans les trois derniers tubes (E1, E2 et E3), nous avons mesuré l’activité enzymatique de l’extrait de tissu bovin fœtal, de la fraction non retenue, de la fraction de lavage et de nos trois tubes E1, E2 et E3, avec un spectrophotomètre couplé à un traceur. Ainsi, nous avons pu savoir si la fraction non retenue et/ou la fraction de lavage contenait également notre enzyme.

[pic 9]Le spectrophotomètre est un appareil qui permet de mesurer l'absorbance d'une solution à une longueur d'onde donnée ou sur une région donnée du spectre. Selon la loi de Beer-Lambert, l'absorbance d'une solution est proportionnelle à la concentration des substances en solution, à condition de se placer à la longueur d'onde à laquelle la substance absorbe les rayons lumineux. C'est pourquoi la longueur d'onde est réglée en fonction de la substance dont on veut connaître la concentration.

Le traceur est en revanche un appareil dessinant une courbe correspondant à la variation de l’absorbance en fonction du temps. Ainsi, lorsqu’un des réactifs ou des produits d’une réaction enzymatique absorbe la lumière, il est possible de mesurer l’activité enzymatique de l’enzyme en question en fonction du temps. Si un réactif absorbe la lumière, alors la disparition de celui-ci au cours de la réaction, entrainera une diminution de l’absorbance de la solution au cours du temps. En revanche, si c’est un produit qui absorbe la lumière, alors l’apparition de celui-ci au cours de la réaction entrainera une augmentation de l’absorbance de la solution au cours du temps.

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