Les récepteurs tlr

Les récepteurs de reconnaissance de formes reconnaissent les motifs largement conservés des agents pathogènes et sont essentiels pour déclencher une réponse immunitaire contre les microorganismes envahisseurs.Les récepteurs de type Toll (TLR) sont une famille de récepteurs de reconnaissance de modèles codés par la lignée germinale et connus pour activer des réponses inflammatoires rapides lors de la détection de leurs ligands apparentés [1]. Les TLR sont des protéines transmembranaires de type I comportant de nombreux motifs de répétition extracellulaires riches en leucine (LRR) qui forment ensemble un solénoïde en forme de fer à cheval, responsable de la liaison du ligand. La partie cytoplasmique de chaque TLR contient un domaine d'homologie du récepteur Toll / interleukine-1 (TIR) ​​qui, lors de la dimérisation de deux TLR, initie une cascade de signalisation conduisant à l'activation de facteurs de transcription tels que NF-KB ou AP-1, et ensuite production de cytokines pro-inflammatoires [2].

Il est reconnu que la plupart des génomes de vertébrés ont au moins un gène représentant chacune des six grandes familles de TLR (TLR1, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 et TLR11) [3]. De plus, chez les poissons osseux modernes (Teleostei), le nombre de familles Tlr correspond généralement à ce que l'on trouve chez la plupart des vertébrés (supérieurs), bien qu'il ne soit pas inhabituel de trouver des gènes tLr dupliqués en raison de plusieurs événements de duplication du génome entier spécifiques du poisson [ 4], [5], [6], [7] et [8]. En plus de ces duplications, certains nouveaux Tlr semblent être «spécifiques au poisson», tels qu'une forme soluble de Tlr5, et Tlrs 18–27 [9] and [10], indiquant qu'une expansion de Tlrs s'est produite au cours de l'évolution. des téléostéens.À ce jour, on sait peu de choses sur les spécificités de TRLs chez les poissons chez les poissons, car les ectodomaines LRR de TIRS ne sont pas toujours hautement conservés et l'information de séquence à elle seule ne peut en déduire des propriétés fonctionnelles [10]. Contrairement à la variation des ectodomaines, les domaines TIR intracellulaires des TIR de poisson semblent hautement conservés et la signalisation en aval via des molécules bien décrites telles que MyD88, Irak1 et Traf6 identifiées chez plusieurs espèces de poisson, suggère l'existence d'un mécanisme conservé de signalisation immunitaire innée. [11]

Cependant, des études sur les propriétés de liaison des ligands de poissons Tlrs sont essentielles pour caractériser leur fonction exacte au sein du système immunitaire des poissons

La famille de mammifères TLR1 comprend les TLR1, 2, 6 et comprend également le TLR10. TLR2 reconnaît divers composants microbiens, notamment les lipoprotéines / lipopeptides, le peptidoglycane et l’acide lipotéichoïque de bactéries à Gram positif, le lipoarabinomannane de mycobactéries, les ancres glycosylphosphatidylinositol de parasite et le zymosan fongique (revue par Takeda et al. [1]).

TLR2 fonctionne comme un hétérodimère avec TLR1 ou TLR6; l'hétérodimère TLR2 / TLR1 reconnaît une variété de lipoprotéines triacylées [12], tandis que le TLR2 / TLR6 reconnaît les lipoprotéines diacylées dérivées d'un mycoplasme [13]. TLR6 et TLR10 semblent être apparus en tant que paralogues de TLR1 dans la lignée des mammifères, avec TLR10 trouvé chez l'homme. Ni TLR6 ni TLR10 n'ont été identifiés dans les génomes d'aucun vertébré inférieur, y compris les téléostéens. Chez les poissons, Tlr1 et Tlr2 ont été identifiés pour la première fois chez le fugu [14] et le poisson zèbre [15] and [16]. Par la suite, Tlr1 et / ou Tlr2 ont été décrits chez plusieurs espèces de poissons; Plie japonaise (Paralichthys olivaceus) [17], poisson-chat d'Amérique (Ictalurus punctatus) [18] et [19], truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) [20] et [21], Tetraodon (Tetraodon nigroviridis) [22], tacheté d'or le mérou (Epinephelus coioides) [23], le grand croaker jaune (Larimichthys crocea) [24], [25] and [26] et le rohu (Labeo rohita) [27]. Cependant, les études sur les propriétés de liaison au ligand de molécules Tlr1 et / ou Tlr2 de poisson ont été rares.

Nous avons précédemment identifié et caractérisé la carpe commune (Cyprinus carpio) Tlr2 [28] and [29]. La transfection de cellules HEK293 humaines avec la carpe tlr2 a suggéré la capacité de se lier aux ligands prototypiques de TLR2, LTA, PGN et Pam3CSK4. La stimulation des macrophages de la carpe par la PGN induit l'expression du gène tlr2, la phosphorylation de MAPK-p38 et conduit à une production accrue de radicaux azote et oxygène. Nous présentons ici l’identification de Tlr1 et la caractérisation moléculaire de l’ARNm et de la structure génomique de tlr1 et tlr2 provenant de carpes communes. Nous comparons l'expression des gènes de tlr1 et tlr2 dans les mêmes échantillons de tissus et populations de cellules purifiées et décrivons nos efforts pour caractériser la fonction d'hétérodimères supposés Tlr1 / Tlr2 en étudiant la localisation subcellulaire et les propriétés de liaison au ligand. Nous discutons des limites possibles lors de l'étude de l'activation spécifique de ligand de NF-κB après surexpression de Tlr1 et / ou Tlr2 dans des lignées cellulaires humaines mais également de poisson, et proposons des stratégies alternatives pour étudier les propriétés de liaison de ligand de Tlrs de poisson.

2. Matériels et méthodes

2.1. Animaux

La carpe commune européenne (Cyprinus carpio L.) a été élevée dans l'installation de poisson centrale Carus, à l'université de Wageningen, à Wageningen, aux Pays-Bas. Les poissons ont été maintenus à 23 ° C dans de l'eau du robinet traitée par UV en recirculation et nourris tous les jours avec des aliments secs en granulés (Sniff, Soest, Allemagne). Les carpes R3 × R8 sont les descendants hybrides d'un croisement entre des poissons d'origine polonaise (souche R3) et hongroise (souche R8) [30]. Les carpes avaient entre 9 et 11 mois au début des expériences. Toutes les études ont été effectuées avec l'approbation du co

2.2. Isolement d'organes

Les carpes ont été euthanasiées avec 0,3 g / L de méthane sulfonate de tricaïne (TMS, Crescent Research Chemicals, Phoenix, Arizona, États-Unis) tamponné avec 0,6 g / L de NaHCO3. Les carpes ont été prélevées dans la veine caudale à l’aide d’une aiguille et d’une seringue contenant du milieu cRPMI (RPMI 1640 avec HEPES à 25 mM (Lonza, Bâle, Suisse), ajustée à une osmolalité de 280 mOsm / kg avec de l’eau stérile) contenant 50 U / mL d’héparine (Leo Pharma, Ballerup, Danemark), pénicilline G 50 U / mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis) et sulfate de streptomycine 50 ug / mL (Sigma-Aldrich). Pour isoler les leucocytes du sang périphérique (PBL), le sang héparinisé a été centrifugé à 100 g pendant 5 min à 4 ° C, puis à nouveau pendant 5 min à 300 g. La couche de buffy a été collectée, soigneusement déposée sur du Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Little Chalfont, Royaume-Uni) et centrifugée à 800 g pendant 25 min à 4 ° C sans frein. La couche de leucocytes a été recueillie et lavée deux fois avec du cRPMI. Les PBL obtenus ont été conservés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation pour l'isolement de l'ARN. Après avoir saigné le poisson, les organes d'intérêt ont été prélevés de manière aseptique et immédiatement congelés dans de l'azote liquide et conservés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation pour l'isolement de l'ARNmité local de protection des animaux (DEC) de l'université de Wageningen.

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