Les problèmes d'dahérences et problèmes physiologiques cellulaires associés

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1. Introduction

La Matrice extra-cellulaire (MEC) est une substance inter-tissulaire, plus ou moins liquide selon sa localisation. Elle est composée de protéines fibreuses (la fibronectine, la laminine, le collagène, et l’élastine) ainsi que de chaînes de glycosaminoglycanes (GAG) qui sont souvent liées à des protéines formant ainsi des protéoglycanes (selon leur abondance, nous aurons une texture plus ou moins de gel). La MEC est fabriquée par des cellules spécialisées, les fibroblastes, dans les tissus conjonctifs (chondroblaste pour le cartilage, ostéoblaste dans les os etc, …).

Elle joue un rôle très important dans l’organisation des cellules en tissus : elle détermine les propriétés des tissus. De plus elle aide à coordonner les fonctions cellulaires par l’activation de voies métaboliques (à l’aide de signalisations intracellulaire), ou par des fonctions d’adhérences ce qui permet un contrôle de la croissance, de la prolifération et de la différenciation des cellules.

La MEC est le principal support d’adhérence chez les organismes différenciés. Par conséquent elle a un rôle essentiel, vital au développement d’un organisme multicellulaire différencié comme le nôtre, il est donc important de comprendre son fonctionnement.

Les objectifs de ce TP sont donc d’étudier les interactions des cellules avec la matrice extracellulaire in vitro afin de mieux comprendre certains mécanismes présents in vivo. Pour cela, des supports moléculaires différents sont utilisés afin de pouvoir étudier l’influence de différents types d’adhésion sur les différenciations cellulaires. La différenciation des cellules neuronales ainsi que l’adhésion et la multiplication des fibroblastes seront ainsi étudiés.

Le stade embryonnaire est l’état cellulaire le plus adapté pour étudier cette MEC, en effet les cellules sont encore pluripotentes, c’est à dire qu’elles peuvent donner tous les types cellulaires. Durant ce stade la MEC joue un rôle essentiel dans les systèmes de reconnaissances, migrations et de différentiations cellulaires. Elle est donc très active. De plus, l’embryon de poulet est un modèle pratique, peu coûteux et facile à obtenir.

Nous cherchons à identifier les capacités d’adhésion, migration et d’agrégation des cellules cérébrales de l’embryon selon le type de support d'adhésion utilisé dans le milieu de culture.

1. Matériel et méthode :

Lors de ces expérimentations deux types cellulaire sont étudiées :

• Les fibroblastes sur lesquels nous testerons leur adhérence, leur migration ainsi que différents protocoles de marquages subcellulaires. Ce sont des cellules de tissu conjonctif qui sécrètent les composés de la matrice extracellulaire. Ils ont un potentiel de division très fort ce qui permet de réaliser de nombreuses études sur ces cellules. En effet, ils ont une multiplication rapide et se développent très facilement in vitro contrairement à d’autres cellules.

• Les cellules de types neuronales sur lesquelles nous réaliserons des tests d’adhérences sur différents supports comme le plastique seul ainsi que des milieux de revêtements s’apparentant plus au milieu in vivo comme la fibronectine et la poly L-lysine. Les cultures de cellules neuronales sont plus difficiles à obtenir que les fibroblastes car ces cellules se cultivent moins bien in vitro et qu’elles demandent beaucoup d’entretien.

1. Animal 

Des œufs de poules fécondés sont placés 1 semaine en couveuse à une température de 30°C avec reproduction des mouvements de retournement comme le fait la mère, geste indispensable au développement des tissus important (comme le Système nerveux, et la création de gradient).

L’embryon et les annexes embryonnaires :

Dans un premier temps nous avons effectué une dissection d’un embryon de poulet (âgé de 7 jours, l’embryogénèse se fait sur 21 jours). Pour cela nous avons ouvert l’oeuf par le dessous, prélevés l’embryon sans ses annexes embryonnaires et sélectionnés les hémisphères cérébraux.  

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1. Matériel

• Un œuf contenant un embryon de poulet (gallinacé) (matériel de dissection stérile)
• Hotte à flux laminaire pour le travail en milieu stérile

Trois milieux de culture communs aux 2 parties :

• DMEM base: milieu de culture de base pour la culture cellulaire, ici il nous permet de faire les dissections.

• (Dubelco Modified Eagle Medium) base

• DMEM à 20% SFV: milieu de base supplémenté en sérum de veau foetal SVF à 20%. Ce milieu riche en facteur de croissance apporté par le SVF permet une culture optimale des cellules neuronales.

• Ajout de 200mL de sérum de veau foetal pour 1L final de milieu de culture final.

• CEF = DMEM 5% SVF 1%SP: milieu de base supplémenté à 5% en sérum de veau foetal et à 1% en sérum de poulet. Ce milieu de culture permet la croissance des fibroblastes, en effet, le SVF apporte les facteurs de croissances nécessaire à tous types de cellules et le sérum de poulet ceux spécifique à la croissance des cellules aviaires. De plus les antibiotiques empêchent les contaminations diverses.

• 500mL de DMEM 4,5g/l glucose +  0,6mL  de Sérum poulet SP + 2,5mL SVF Antibiotiques+ antifongiques X10 : 5ml

Solutions

• Trypsine: permet le décollement des  cellules par ruptures des liaisons cellule-matrice.
• Bleu trypan: colorant de viabilité cellulaire, il pénètre les cellules mortes qui sont donc incapable de l’éliminer. Les cellules mortes apparaissent en bleu ce qui permet de les distinguer lors de comptages en cellule de Malassez. .
• Acide acétique/Méthanol, PFA (paraformaldhéyde): permet la fixation des cellules sur les lames afin de les colorer par la suite.
• PBS : tampon phosphate, il permet de laver les cellules dans des conditions physiologiques.
• Acridine orange : marqueur des acides nucléiques qui émet dans la fluorescence.
• Glycérol : permet la fixation de la lamelle sur la lame et la protection des cellules.

1. Protocole de fabrication des solutions de revêtement :

Milieux de culture pour 10 boites de revêtement

Protocole solution fibronectine :

1. Laisser dissoudre 1 mg (balance de précision) de fibronectine pendant 30 minutes à 37°C dans 1 mL (P1000) d’eau stérile.
2. On obtient une solution a 1g/L.
3. Les boîtes de cultures faisant 40 mm de diamètre, elles ont une surface de 12.56 cm², il faut 2 µg/cm² soit 25.12 µg par boîte.
4. On veut faire 10 boîtes, il nous faut donc 100 µL par boîtes avec 25.12 µg ce qui nous fait une concentration de 0.25g/L.
5. Il ne reste plus qu’à diluer 250 µL (P1000) de solution de fibronectine dans 1 mL final de tampon EEBS (chlorure de sodium, chlorure de potassium, sodium monophosphate, bicarbonate de sodium).
6. Disposer 100 µL par boîtes et laisser sécher 45 min à température ambiante.

protocole solution tampon borate 0.1M:

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