Etud edes conséquences de la rupture d'adhésion sur les cellules 3T3 et CHO

Étude des conséquences de la rupture d'adhésion sur les cellules 3T3 et CHO

Résumé

L'équipe a étudié les effets de la perte d'adhérence de cellules immortalisées (3T3), et de cellules tumorales (CHO), afin de déterminer si la rupture d'adhérence permet de limiter la prolifération des cellules des deux lignées. Pour cela, les cellules ont été cultivées en adhérence ou en absence d'adhérence, temporaire (24 heures), ou prolongée (72 heures). La perte d'adhérence prolongée a entraîné une augmentation significative de la mort cellulaire chez les cellules 3T3 et chez les cellules CHO. Chez les cellules 3T3, on observe une diminution progressive du nombre de cellules, alors que les cellules CHO continuent de proliférer, malgré une augmentation de leur temps de génération. On en conclut que la perte d'adhérence prolongée n’empêche pas les cellules CHO de se multiplier. Le retour en conditions adhérentes après perte d'adhérence temporaire montre une augmentation du temps de génération des cellules 3T3, et une diminution du temps de génération des cellules CHO par rapport aux conditions adhérentes. La rupture d'adhérence engendre une désorganisation du cytosquelette d'actine et des microtubules, et ce pour les deux lignées. L'étude de la cycline D1 montre une forte absence de cycline D1 en cas de rupture d'adhérence pour les cellules 3T3, alors que la concentration dans les cellules CHO ne varie pas. L'ensemble des résultats montre que les cellules CHO supportent mieux la rupture d'adhérence que les cellules 3T3.

Mots-clés : prolifération cellulaire, CHO, 3T3, adhérence, méthocel, cycline D1

Introduction

L'étude vise à tester le rôle de l'adhérence et la réponse à la perte d'adhérence de deux lignées cellulaires eucaryotes : la lignée 3T3, des cellules immortalisées épithéliales de souris1 et la lignée CHO, cellules tumorales d'ovaire de hamster chinois. Ces deux lignées sont des lignées adhérentes, c'est-à-dire qu'elles nécessitent d'adhérer à un substrat pour proliférer. Des travaux préalables ayant montré que les cellules 3T6 nécessitent des conditions d’adhérence pour proliférer et que la rupture de cette adhérence provoque d’importants changements métaboliques (notamment au niveau de la synthèse d’ARNm)2, notre étude poursuit l’analyse en comparant les cellules 3T3 et CHO.

Les cellules eucaryotes ont besoin de deux éléments pour proliférer : l'adhésion à un substrat et des facteurs de croissance. L'adhésion au substrat fait intervenir des protéines transmembranaires, les intégrines qui, lorsqu'elles se lient à d'autres molécules présentent sur le substrat, entraînent une voie de signalisation aboutissant à la survie cellulaire et à la prolifération. En parallèle, la membrane cellulaire contient des récepteurs reconnaissant des facteurs de croissance, lesquels entraînent par une cascade de réaction la prolifération cellulaire et inhibent l'apoptose. Ces deux voies de signalisation sont liées et interdépendantes, comme l’ont montré les travaux de Xaioyun Zhu et al.3 ainsi que les travaux de Richard K. Assoian et al.10. L'étude de l'impact de chacune de ces voies sur les cellules cancéreuses et leur capacité de prolifération nécessite d'inhiber l'une des voies afin de déterminer ses effets : ici, c'est la voie de signalisation liée à l'adhésion et faisant intervenir les intégrines qui sera étudiée.  

La lignée 3T3 est immortalisée mais non transformée : elle est toujours différenciée (forme allongée) et conserve l'inhibition de contact, c'est-à-dire qu'une fois la confluence atteinte, elles cessent de se multiplier. Dans les conditions d'étude (boite de 25cm2, ensemencement à 3.10⁵), les cellules de cette lignée atteignent la confluence en 3 jours environ. Ces cellules sont très proches des cellules de la lignée 3T6, étudiées par George J. Todaro et al.1.

La lignée CHO est transformée : en plus d'avoir acquis un caractère immortel, elles ont perdu l'inhibition de contact. Les cellules sont dédifférenciées, elles sont petites et cubiques.

L’utilisation de cellules immortalisées comme souche de référence n’est pas optimale : les cellules 3T3 sont reconnues comme étant métaboliquement plus actives que des cellules non immortalisées1. Cependant, la difficulté de culture et de conservation de lignées non immortalisées est telle que son utilisation n’aurait pas été judicieuse. L’étude a donc porté sur les cellules les plus proches possibles.

On cherche à comparer la réaction (adaptation ou absence d'adaptation) des cellules tumorales par rapport à la réaction des cellules immortalisées en situation de stress (rupture d'adhérence). Pour cela, on ensemence les cellules dans 3 conditions : en conditions adhérentes (ci-après nommées plastiques ou P), en condition rupture d'adhérence prolongée dans un milieu Méthocel (Méthyl-Cellulose, ci-après nommé M) et en retour sur milieu adhérent après 24 heures en conditions de rupture d'adhérence (ci-après nommé retour plastique ou RP). Les cellules sont cultivées selon ces trois conditions pendant trois jours pour déterminer plusieurs paramètres : les temps de génération, le nombre de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire, l'expression de cycline D1, protéine régulatrice de la transition G1-S, l'architecture des cytosquelettes d'actine, des microtubules et la localisation de la cycline D1 dans la cellule.

L'étude a montré que les cellules CHO sont significativement plus aptes à se développer en absence d'adhérence et en retour en conditions adhérentes après une rupture d'adhérence temporaire.

Résultats

La densité des cellules CHO est plus importante que celle des cellules 3T3 et les cellules CHO forment des amas en rupture d'adhérence.

Les cellules 3T3 sont des cellules allongées, fusiformes, relativement grandes. Les cellules CHO sont des cellules relativement petites, cubiques. Il faudra tenir compte de la différence de taille dans le calcul de la densité : les cellules CHO étant plus petites, leur densité est plus forte à nombre de cellule égal.

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