Détermination De La Carte De Restriction Du Plasmide PUC18-wzc

I.BUT

Nous souhaitons établir la carte de restriction de l’ADN plasmidique de pUC18-wzc, et calculer le rendement de l’extraction du gène wzc. Nous tenterons d’y parvenir en faisant agir différentes enzymes de restriction sur cet ADN plasmique puis migration par électrophorèse en gel d’agarose. Ensuite, nous déterminerons la quantité et la concentration du gène wzc extrait de ce gel.

II.PRINCIPE

a)Préparation d’ADN plasmidique pUC-wzc

Dans la solution I, l’EDTA (chélateur des ions Mg 2+) protégeant l’ADN d’intérêt contre la dégradation par les nucléases présentes en les rendant inactives, car le bon fonctionnement des nucléases nécessite la présence des ions Mg2+.

La présence de soude dans la solution II, permettra de dénaturer l’ADN indifféremment, que ses soit l’ADN plasmidique, ou l’ADN génomique présents dans les bactéries.

La solution III, contient de l’acide acétique à 2M, soit un pH acide à 5,2. L’ajout de cette solution dans le milieu neutralisera la soude de la solution II ajoutée précédemment. La neutralisation du pH du milieu permettra à l’ADN plasmidique de se réhybrider plus facilement.

L’ajout de phénol éliminera les protéines présentes dans le milieu, et l’utilisation de chloroforme permettra aux protéines restant dans la phase aqueuse (contenant l’ADN plasmidique d’intérêt) d’être extraites de cette phase pour passer dans la phase organique.

L’ADN qui restera dans la phase aqueuse sera précipité par l’utilisation d’éthanol.

b) Enzymes de restriction

Afin de pouvoir établir la carte de restriction du plasmide wzc, c'est-à-dire déterminer précisément la position sur ce plasmide les sites de restrictions enzymatiques, nous allons utiliser des enzymes de restriction (SalI, PvuI, MluI, EcoRI, et BamHI).

Ces enzymes sont des endonucléases reconnaissant les sites spécifiques (palindromes) à chacune d’entre elles. La spécificité extrêmement haute de ces enzymes de restriction pour leurs sites d’action permettra de fractionner le plasmide en fragments définis.

Ensuite, par comparaison des tailles des différents fragments obtenus après digestion de différentes enzymes, nous pourrons construire la carte de restriction précisant la position des sites de restriction spécifique à chaque enzyme sur le plasmide wzc, par le principe d’additivité de la taille des fragments d’ADN obtenus après action de ces enzymes de restriction.

c) Electrophorèse en gel d’agarose

L’électrophorèse en gel d’agarose nous permettra de savoir les tailles exactes des fragments d’ADN plasmidique obtenus après digestion par plusieurs enzymes de restriction. Ceci grâce à un ensemble de fragments d’ADN marqueur linéaire de taille connu ayant migrés sur ce même gel.

Un champ électrique est appliqué au gel d’agarose en présence d’une solution tampon conduisant l’électricité. Les fragments d’ADN étant chargés négativement (due aux phosphates des nucléotides constituant ce fragment), ils migreront vers l’anode (électrode positive), à une vitesse dépendant de la taille et de la forme de ces fragments.

Les petits fragments se déplaceront plus rapidement que les gros fragments qui sont retardés du fait du plus gros volume occupé par ces derniers avec le réseau de fibres d’agarose constituant le gel.

d) Isolement et purification de fragment d’ADN

Le gel d’agarose obtenu après électrophorèse, nous permettra d’isoler le fragment wzc cloné dans pUC-18 parmi les fragments d’ADN générés par la digestion. Sachant où a migré ce fragment, nous pouvons directement le prélevé du gel.

Le fragment découpé du gel est ensuite traité pour purifier l’ADN plasmidique d’intérêt de l’agarose contaminant et du Bromure d’éthidium (BET) utilisé pour marquer les fragments afin de les révélés sur la plaque de gel par lumière ultraviolette.

• Etapes de la purification :

Le morceau de gel d’agarose est dissout puis disposé sur un minicolonne chargée positivement afin de retenir l’ADN chargée négativement, il s’agit ici d’une purification par chromatographie échangeuses d’anions. Tous ce qui ne fixe pas la colonne est élué, c'est-à-dire l’agarose et le BET, par une solution de lavage (« washing solution »). La colonne est centrifugée à vide afin de pouvoir éliminer un maximum des éléments n’ayant pas fixé la colonne. Le gène wzc est ensuite élué par un tampon d’élution et récupéré.

III.ANALYSE DES RESULTATS

a) Préparation du plasmide

• Formes théoriques/ formes obtenues :

L’ADN plasmidique non digéré (piste 1) est présent sous deux formes du fait de la présence de deux bandes sur la piste 1. La bande supérieure est moins mobile, ceci est due à la forme super-enroulée prise par l’ADN par le fractionnement d’un seul brin. Cette forme est de conformation ouverte circulaire, de ce fait est plus encombrante, possédant donc une faible mobilité. Ces deux formes sont des topoisomères d’ADN circulaire bicaténaire.

La bande inférieure est plus mobile, car elle est constituée d’ADN plasmidique sous forme relâchée. Cette forme possède une meilleure mobilité en raison de sa conformation compacte, pouvant ainsi mieux circuler au travers du réseau de mailles constituant le gel d’agarose.

• Rôle de la Ribonucléase ( RNase) :

La présence de la RNase dans le milieu est nécessaire afin digérer toute éventuelle contamination par de l’ARN. Cette enzyme n’aura aucun effet sur notre ADN d’intérêt.

b) Carte de restriction

• Pouvoir résolutif des gels:

A différentes concentrations les gels d’agarose ne disposent pas des mêmes capacités résolutives.

En effet, à 1% d’agarose les mailles constituants le gel sont très serrées, de ce fait les gros fragments migreront peu alors que les petits fragments traverserons plus facilement les mailles du gel. Et inversement, pour le gel

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