Electrophorèse De Protéines, électrotransfert Et Immunorévélation

Electrophorèse de protéines, électrotransfert et immunorévélation

I. But :

Le but de ce TP est de vérifier si le lysozyme a bien été purifié. Nous réaliserons en premier lieu une électrophorèse dénaturante colorée à l'aide du bleu de Coomassie sur gel de polyacrylamide. Cela va nous permettre de connaitre la pureté des essais ainsi que la structure de chaque protéine. Après électrotransfert et immunomarquage, on effectuera une deuxième électrophorèse qui nous permettra d’identifier spécifiquement le lysozyme. Nous en déduirons ensuite sa structure et son poids moléculaire ainsi que ceux de l'ADH.

II. Principes:

II. 1.Principes de l'électrophorèse :

L'électrophorèse est une méthode de séparation de particules en fonctions de leur charge et de leur taille lorsqu’elles sont placées sous l'influence d'un champ électrique. La vitesse de migration, et donc la référence frontale (Rf = front de migration de la molécule / front du solvant (ici hauteur du gel)) sont caractéristiques d’une molécule. La chromatographie permet également d’estimer la présence d’une particule et donc de la purification d’une solution.

L'électrophorèse sur gel en polyacrylamide que l'on va réaliser au cours de ce TP est différente d'une électrophorèse classique car la séparation des protéines se fait en présence de SDS ce qui confère aux protéines la même charge électrique (négative). Cela permet alors de ne pas les séparer en fonction de leur charge mais selon leur masse moléculaire. En effet, toutes les protéines migreront vers le pôle positif.

On utilise donc un gel de polyacrylamide, fait à partir d’un mélange d’acrylamide et de bis-acrylamide, qui va former un réseau responsable du tamisage moléculaire permettant la séparation. La polymérisation de l’acrylamide est initiée à partir d’une réaction radicalaire par l'addition au persulfate d’ammonium et de TEMED (catalyseur).

De plus, on utilise un mélange témoin de protéines dont les masses moléculaires sont connues. On pourra alors les comparer et mettre en relation la masse moléculaire et la distance de migration par la relation : log (MM) = f(distance de migration)

Le système du gel est discontinu, il y aura deux migrations successives. D'abord avec un gel de concentration qui va permettre de concentrer les protéines en une bande de dépôt nette et fine. Le maillage étant très peu réticulé les protéines sont assez peu retenues par les maillages, mais il y a présence de deux types d’ions qui permettent de réguler leur migration : un migrant très rapidement et poussant les protéines, tandis que l’autre va très lentement et les retient. On obtient ainsi une bande fine où toutes les protéines sont concentrées, ce qui constitue un bon point de départ à la migration et d’obtenir une meilleure résolution dans le gel de migration.

Plusieurs gels de séparation sont réalisés (7.5% ou 15%) au niveau duquel se fera la séparation des protéines. Plus la concentration en polyacrylamide- bis-acrylamide est élevé, plus le maillage serra fin. Ce caractère sera déterminant pour la séparation des protéines : une particule de haut poids moléculaire migrera moins vite qu’une particule à faible MM puisqu’elle sera plus retenue par les mailles de polyacrylamide- bis-acrylamide.

On utilise ici du Dodécyl Sulfate de Sodium (SDS), un détergent anionique fort et un dénaturant, car il détruit la structure tridimensionnelles des protéines, il confère également une charge négative à toutes les protéines à séparer. Celles-ci formeront une bande au niveau du pôle + (anode) de l'électrophorèse et migreront jusqu'au pôle moins (cathode) en fonction de leur masse moléculaire. Les protéines de faible poids moléculaire migreront plus vite et donc plus loin que les molécules qui ont un poids moléculaire plus élevé. On utilise également du β-mercaptoéthanol qui a pour propriété de cliver les ponts disulfures. On obtient ainsi la structure des protéines : si ces ponts disulfures sont interchaîne, on sépare les sous-unités d’une même protéine ; s’ils sont intrachaine la molécule migrera moins loin que les protéines encore repliées sur elle-même.

II.2. Principe de l'électrotransfert :

L'électrotransfert permet aux protéines séparées par électrophorèse d'être accessibles à l’anticorps pour l’immunomarquage car celui-ci ne peut pas les atteindre dans le gel électrophorétique. Les protéines sont donc transférées sur une membrane de nitrocellulose grâce à un champ électrique qui est perpendiculaire à l’électrophorèse. La membrane va alors fixer de façon non spécifique (interactions ioniques et hydrophobes) les protéines transférées.

II.3. Principe de l'immunomarquage (Western Blot):

L'immunomarquage permet l'identification spécifique d'une protéine d'intérêt (lysozyme) à l'aide d'anticorps dirigés contre celle-ci (anti-lysozyme). Cet anticorps peut être couplé à un marqueur ou bien être reconnu par un anticorps anti-anticorps lui même marqué.

Avant la révélation spécifique, on réalise une étape de coloration non spécifique dans le but de vérifier la présence de nos protéines sur la membrane. Elle se fait grâce au rouge ponceau, un colorant non dénaturant (pour que la protéine soit toujours reconnue par l’anticorps) et éliminable facilement par rinçages.

Dans ce TP, on utilise une méthode de révélation par immunomarquage enzymatique, c'est-à-dire que l’anticorps utilisé est lié à une enzyme. Cette enzyme, lorsqu’elle est mise en présence de son substrat réagit et donne une coloration spécifique. Ces anticorps anti-lysozyme sont liés à l'enzyme peroxydase qui réagit avec le H2O2 et forme un produit brun. Le lysozyme est ainsi localisé et on peut avoir un aperçu de la quantité présente par l’intensité de la coloration.

Mais avant notre étape de révélation il est nécessaire de procédé à une étape de blocage. La membrane ayant une affinité non spécifique avec les protéines, on doit la saturer avec des protéines non détectables par nos anticorps. La membrane doit tremper dans une solution de TBS et de lait écrémé (1%) afin d’obtenir un film monomoléculaire de caséine. Cela permet d'éviter toute interaction non spécifique avec les anticorps et de prévenir de bandes parasites. De plus, le TBS est un tampon nous permettant d’ajuster

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