TP SDS-PAGES

TP SDS-PAGES

1. BUT

Le but de ce TP est de vérifier si notre échantillon de lysozyme récupéré à partir de blanc d’œuf par chromatographie échangeuse d’ions lors de notre précédant TP est convenablement pure. Pour cela nous avons réalisé plusieurs électrophorèses sur gel de polyacrylamide en milieu dénaturant puis un électrotransfert suivi d’une immunorévélation de nos protéines sur membrane de nitrocellulose.

1. PRINCIPES

L’électrophorèse est une méthode analytique permettant de séparer des protéines en solution dans un champ électrique. La séparation se réalise en fonction de la charge électrique ou de la masse moléculaire. Dans notre cas nous avons séparé nos protéines en fonction de la masse moléculaire. Nous avons utilisé un gel de polyacrylamide qui est un support constitué de pores dont le diamètre dépend de la concentration en acrylamide : plus la concentration en acrylamide est élevée plus le diamètre des pores est petit donc plus la vitesse de migration des protéines est faible. De plus les protéines de plus petites masses moléculaires migreront plus rapidement que les protéines de plus grandes masses moléculaires. De ce fait, les petites molécules auront une distance de migration plus importante que les grosses molécules. En effet nous avons préparé nos échantillons en mélangeant nos protéines avec différentes substances :

• Du SDS (sodium dodécyl sulfate) qui nous a permis de charger négativement toutes nos protéines qui migreront toutes vers l’anode (pôle positif), la distance de migration dépendra donc du poids moléculaire des protéines. Le SDS est un détergent très puissant qui va dénaturer les protéines en détruisant leurs liaisons non covalentes.
• Du glycérol 25% a été ajouté afin d’augmenter la masse nos échantillons pour que ces derniers puissent descendre avec précision dans les puits.
• Du bleu de bromophénol, un colorant utilisé pour obtenir une meilleure visualisation de nos bandes. C’est un indicateur de pH qui devient bleu en milieu basique
• Du Béta-mercaptoéthanol a été utilisé dans certains tubes. Ce réducteur permet de casser les ponts disulfures présents dans les protéines.

De plus nous avons ajouté deux initiateurs dans nos gels de séparation et de concentration, le TEMED et le persulfate d’ammonium. Ces constituants permettent d’obtenir un radical SO4- qui va déclencher la polymérisation de nos gels à partir de la réaction suivante :

Après migration de nos échantillons sur le gel, une étape de coloration (bleu de coomassie) et de décoloration ( mélange éthanol/acide acétique/eau ) est indispensable. Elle permet ensuite de visualiser nos bandes et ainsi exploiter les résultats de notre électrophorèse.

 Le western blot est une technique qui permet de détecter et d’identifier des protéines d'intérêts dans un échantillon par l’action d’un anticorps spécifique. Cette méthode est constituée de 3 grandes étapes :

1. Une électrophorèse sur gel qui permet de séparer les protéines d’un mélange en fonction de la masse moléculaire.
2. Un électrotransfert qui permet de transférer les protéines depuis un gel d’électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose. En effet, le gel et la membrane de nitrocellulose sont placés face à face dans une cuve contenant un tampon de transfert. Par application d’un champ électrique, les protéines vont migrer du gel (côté pôle négatif) vers la membrane (côté pôle positif) tout en conservant leur organisation qu’elles avaient sur le gel. La fixation des protéines à la membrane se fait grâce à des interactions hydrophobes. Cette étape permet de rendre les protéines accessibles à la détection par anticorps. Les protéines fixées à la membrane sont ensuite révélées par coloration au rouge ponceau.
3.  Une immunorévélation est ensuite réalisée pour vérifier que la protéine que nous avons réussi à purifier est le lysozyme, pour cela cette technique met en jeu un anticorps spécifique : l’anti lysozyme. Tout d’abord, du TBS-lait est ajouté à la membrane de nitrocellulose pour bloquer les sites libres de celle-ci. Cette étape est indispensable pour obtenir des résultats plus fiables, elle permet d’éviter que les anticorps en excès puissent se fixer à la membrane. Ensuite il est donc possible d’ajouter une solution d’anticorps anti-lysozyme qui sera dirigée contre les fragments protéiques du lysozyme jouant ici le rôle d’antigène. L’épitope de l’antigène va donc être reconnu spécifiquement par le paratope de l’anticorps. La solution d’anticorps est couplée à des marqueurs enzymatique (peroxydase) qui permettront d’interagir avec une solution de substrat ( 4 chloro-1-naphtol ). L'interaction entre l’enzyme et le substrat est une étape de révélation de type chromogène formant un produit coloré bleu-violet. Cette interaction permet de visualiser l’activité des anticorps couplés à la peroxydase et donc de révéler la présence ou non de notre protéine d’intérêt (lysozyme).

1. RESULTATS DES L’ELECTROPHORESE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE EN MILIEU DENATURANT

La 1ère manipulation de ce TP consistait à tester la pureté de nos échantillons obtenus lors du TP « Purification du Lysozyme » par SDS-PAGES. Les échantillons que nous devions tester étaient la fraction F1 contenant le blanc d’œuf et donc toutes les protéines y compris le lysozyme, la fraction F2 dans laquelle nous devions retrouver les protéines excepté le lysozyme et l’éluat dans lequel nous avions élué le lysozyme (E2).

         Dans un 1er nous avons donc préparé nos 3 échantillons en se basant sur les concentrations massiques en protéines calculées pour le TP n°1 de ces tubes. La masse de protéine des ces 3 tubes devait être de 20µg, ainsi nous pouvions déterminer le volume de solution à prélever et compléter ce volume jusqu'à 20µL avec de l’eau.

Ex tube 5 :

 [c]F1 = 5,23mg.mL-1 = 5,23 µg.µL -1

VF1 = m / ([c] (F1)) = 3,8 µL

VH2O = 20 – VF1 = 20 – 3,8 = 16,2 µL

Ainsi pour réaliser l’échantillon n°5 nous avons prélevé 3,8µL de la fraction F1 et nous avons ajouté 16,2µL d’eau

Pour notre tube 6 : [c]F2 = 1,24 µg.µL -1 → VF2 = 16µL et VH2O = 4µL

Pour notre tube 7 : [c]E2 = 1,32 µg.µL -1 → VE2 = 15µL et VH2O = 5µL

Nous avons par la suite effectué une électrophorèse avec un gel dont la concentration en polyacrylamide et de 7,5% et un gel dont la concentration est de 15%

Sur notre électrophorèse réalisée avec le gel 7,5% nous avons pu noter, en la comparant avec celle réalisée avec le gel 15%, que de nombreuses taches n’étaient pas présentes du fait que le gel 7,5% n’était pas assez concentré. Donc de nombreuses protéines, dont le lysozyme, sont sorties du gel et donc de nombreux résultats ne sont pas exploitables. Pour le tube 7 on observe aucune tâche car seule le lysozyme était présent dans cette fraction et il a trop migré du fait que le gel était moins concentré en polyacrylamide et donc que le diamètre des pores des mailles était moins grand. De plus sur cette électrophorèse nos tâches sont peu visibles et ne sont donc pas exploitables.

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