TP HLPC

Compte Rendu HPLC

But 

Le but de ce TP est d’identifié le site d’interaction d’un peptide d’intérêt avec l’Héparine. Pour cela, nous allons effectuer différentes injections en HPLC (Chromatographie haute performance) : le peptide non digéré, le peptide digéré par l’α-chymotrypsine, et le peptide ayant subi une chromatographie d’affinité.

Principes 

Chromatographie en phase inverse avec appariment d’ions 

Cette chromatographie est une méthode analytique : après passage de l’échantillon dans ce système, les molécules ne sont pas réutilisables.

Elle permet la séparation des composés de l’échantillon en fonction de la polarité de ces composés. En effet la phase stationnaire est plus hydrophobe que la phase mobile, qui est plutôt polaire. Les molécules, qui vont être retenues par la phase stationnaire, ont une faible polarité.  

L’élution des molécules retenues par la phase stationnaire se fait en diminuant la polarité de la phase mobile. L’élution se fait selon l’ordre suivant : les molécules les plus polaires sortiront en premières et les molécules les moins polaires sortiront en dernières.

Cette méthode se base uniquement sur la polarité des composants, il est important que leurs charges n’interfèrent pas dans l’analyse. Nous utilisons donc une technique d’appariment d’ions pour neutraliser les charges. Nous ajoutons un ion compensateur dans l’éluant, il va se lier aux ions présent dans l’échantillon et formé une paire d’ion globalement neutre.

Chromatographie HPLC 

Cette chromatographie permet la séparation et l’analyse d’un échantillon. Elle est basée sur un autre principe de chromatographie (en phase inverse ou échangeuse d’ions), mais elle permet d’améliorer le pouvoir de séparation grâce a l’utilisation de colonne à haute résolution.

La phase stationnaire est composée de nombreuses microparticules poreuses, toutes compactées dans la colonne, avec une faible granulométrie. Le nombre de billes étant plus important que pour une chromatographie classique, la surface d’échange est plus importante. Le tassement de ces nombreuses particules rend le passage de l’échantillon et de la phase mobile difficile, on doit donc induire une pression importante.

Cette chromatographie permet d’avoir des pics très fin, ils seront donc bien séparés et différenciés, la détection et la comparaison est donc plus facile. La résolution est donc de meilleure qualité.

[pic 1] 

Protocole 

Pour réaliser cette HPLC, on utilise une colonne de faible longueur car nous n’avons pas une quantité importante de composés à séparer. Nous utilisons un débit de 1mL/min afin que le premier composé puisse sortir et être détecté avant que le prochain n’arrive à son tour. Cela évite donc que les composés se mélangent.

La phase mobile se compose de deux solvants, le solvant A composé principalement d’eau et le solvant B composé principalement d’acétonitrile. On ajoute également à chacun de ces solvants du TFA (trifluoroacétique) qui est un l’ion compensateur qui permettra de neutraliser les charges de l’échantillon. On utilise l’eau en guise de phase mobile car c’est le solvant le plus polaire qui existe. Pour le choix de l’acétonitrile, nous avons dû prendre en compte la solubilité des molécules dans les différents solvants et la viscosité afin que ce solvant puisse circuler dans la colonne (l’acétonitrile étant trois fois plus fluide que l’eau). Son absorbance (180nm) a également été prise en compte afin qu’elle n’entre pas en compte dans la détection des peptides. Nous injectons la phase mobile suivant un gradient linéaire d’acétonitrile : Le choix d’un gradient linéaire d’acétonitrile pour l’élution est le suivant. Dans les conditions initiales (95% de A et 5% de B), les molécules n’ayant pas d’affinité pour la phase stationnaire vont être éluées et les molécules ayant une affinité vont se fixer à la phase stationnaire. En augmentant linéairement la concentration d’acétonitrile (30% de B), nous allons permettre l’élution progressive des composés retenus en fonction de leur affinité pour la colonne. Puis, on se replace dans les conditions initiales afin de rééquilibrer la colonne.

Pour la détection, on choisit de se placer à 214nm car les protéines se détectent à 280nm grâce à leurs acides aminés aromatiques. Ici, il n’y a qu’un seul acide aminé aromatique et lors de l’hydrolyse un seul des deux fragments comportera cet acide aminé. Nous aurons donc un seul pic sur le chromatogramme au lieu de deux. On se place donc à 214nm afin de détecter les liaisons peptidiques de nos fragments. Nous risquons donc également détecter d’autres éléments que ces deux fragments à cette longueur d’onde.

On effectue différentes injections. Tout d’abord une injection « blanche » composée uniquement de tampon NaCl 0,15M afin de détecter les pics « fantômes » correspondant à des impuretés qui pourraient être contenues dans le solvant ou dans la colonne et apparaitre dans les prochaines manipulations. Ensuite, nous avons fait une injection du peptide non digéré afin de déterminer son temps de rétention et pouvoir suivre son évolution dans les injections suivantes. Une injection du peptide digéré a ensuite été effectuée afin de déterminer le temps de rétention des produits d’hydrolyse du peptide. Enfin, nous avons fait une injection de l’éluat obtenu après chromatographie d’affinité afin de déterminer quel fragment peptidique contient le site d’interaction avec l’héparine. Nous utilisons de faibles volumes d’injection la finesse du capillaire de l’HPLC et la sensibilité de la colonne permettent une séparation de haute qualité avec une grande rapidité de propagation.  

Résultats et interprétation 

Nous avons effectué la première injection, dite « blanche » et nous avons obtenu le premier chromatogramme :

[pic 2] 

Chromatogramme de l’injection « blanche » 

On remarque un seul pic à 0,5 minutes qui correspond au pic d’injection puisqu’il apparait moins d’une minute après le lancement de la chromatographie. On ne remarque pas de pics dits « fantômes », il n’y a donc pas d’impuretés détectées.

Nous avons ensuite fait l’injection du peptide avant digestion :

[pic 3] 

Chromatogramme du peptide non digéré 

On remarque toujours la présence d’un pic d’injection à 0,4 minutes. De plus un autre pic apparait au bout d’environ 9 minutes. Sachant que nous avons injecté le peptide non digéré, ce pic lui correspond donc. On constate un épaulement avant ce pic, ce qui signifie que l’échantillon de peptide commercial n’était pas totalement pur.

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